阮宇菲，劉琦，吳博，許智勇，陳珂，蔣敏之，張俊玲，余金生，陳益平

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童感染科，浙江 溫州 325027；2.安徽醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230000

巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus, CMV）是一種在自然界中廣泛存在的人致病的皰疹病毒，是皰疹病毒亞科家族中的一員。在我國一般人群CMV抗體陽性率為86%～96%，育齡期女性達(dá)90%以上[1]，嬰幼兒期為60%～80%，CMV初次感染一般發(fā)生于兒童時期甚至胎兒期，肝臟是其主要的靶器官之一[2]。臨床上患CMV感染的嬰幼兒，絕大多數(shù)都有肝臟受累的表現(xiàn)，從亞臨床感染到出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)氨酶的升高，肝脾腫大、黃疸及膽汁淤積等嚴(yán)重表現(xiàn)[3-4]，此外CMV感染是實(shí)體器官移植或骨髓移植后最常見的機(jī)會性感染之一，且治療難度大[5-8]。目前CMV的致病機(jī)制仍不明確。研究表明，鼠巨細(xì)胞病毒（murine cytomegalovirus, MCMV）感染的小鼠模型能夠模擬除先天性CMV感染以外的多種臨床疾病[9]，如眼部疾病[10-11]、呼吸系統(tǒng)疾病[12-13]及腫瘤[14]等。但對于肝炎的研究較少見，因此，本研究通過建立MCMV感染小鼠急性肝炎模型，為進(jìn)一步深入研究HCMV感染所致的肝炎的致病機(jī)制、疫苗研制以及探索新型更有效的生物學(xué)治療手段提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)室要求：無特定病原體（specific pathogen free, SPF）級C57BL/6小鼠， 4～6周齡，雄性，體質(zhì)量16～20 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SCXK（皖）2017-001]，本研究獲安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)，并按照美國國立衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。CMV屬于生物安全等級2級（biosafety level-2, BSL-2）[15]，本研究在安徽醫(yī)科大學(xué)具有P2等級標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室開展。

1.1.2 病毒和細(xì)胞株：MCMV Smiths株由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床病毒學(xué)研究所贈予，在原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast, MEF）上進(jìn)行傳代增殖培養(yǎng)。根據(jù)BRIZI等[16]的研究，取孕14 d的BALB/c小鼠胚胎自行制備原代MEF細(xì)胞，按常規(guī)條件培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為2～5代培養(yǎng)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有耗材經(jīng)煮沸、高壓滅菌后按醫(yī)療垃圾處理。

1.1.3 抗體及引物序列：Mouse Anti M112-113/E1 （MCMV）mAb，CROMA103 Kappa IgG，1 mg/mL，由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床病毒研究所贈予，按1∶500稀釋，MCMV早期蛋白1（E1）由MCMV M112-113基因區(qū)編碼，主要定位于MCMV感染細(xì)胞的細(xì)胞核。引物序列見 表1。

表1 引物序列

1.1.4 其他試劑：細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）、Premix Taq、實(shí)時熒光定量PCR試劑TB Green Premix Ex Taq II，均購自日本TaKaRa公司；甲基纖維素購自北京索萊寶公司。

1.2 MCMV感染小鼠急性肝炎模型建立

1.2.1 MCMV擴(kuò)增及滴度檢測：將MCMV接種于原代MEF上進(jìn)行傳代培養(yǎng)及擴(kuò)增，致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect, CPE）達(dá)90%時收獲病毒，并制備MCMV Stocks凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。使用空斑形成?shí)驗(yàn)檢測病毒滴度，將MEF按2×105/孔接種至6孔板中，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞單層長滿后，將10倍系列稀釋的10-6～10-2病毒懸液接種至MEF單層上，200 μL/孔，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附1 h后棄去病毒懸液，按3 mL/孔加入甲基纖維素培養(yǎng)液，于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每日鏡下觀察空斑形成情況，第7天終止，棄去孔板中甲基纖維素培養(yǎng)液，使用含甲醛的結(jié)晶紫染色液染色3 min，流水沖洗，進(jìn)行空斑計(jì)數(shù)，按公式計(jì)算空斑形成單位（plaque forming unit，PFU/mL）=平均空斑數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種病毒懸液（mL）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及病毒接種：實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，將其隨機(jī)分為陰性對照組及病毒感染組（每組n=12）。陰性對照組經(jīng)腹腔注射200 μL的MEF懸液，病毒感染組小鼠經(jīng)腹腔注射1.0×106PFU （200 μL）MCMV懸液，觀察1周內(nèi)小鼠變化。

1.3 MCMV感染小鼠急性肝炎模型鑒定

1.3.1 肝組織內(nèi)病毒分離：在感染后第3天和第7天隨機(jī)抽取6只小鼠，無菌條件下采集小鼠肝臟。取約100 mg的肝組織于無菌條件下進(jìn)行研磨，加1 mL DMEM制備組織勻漿，轉(zhuǎn)移至無菌EP管內(nèi)，3 000 r/min 離心15 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm過濾器過濾后，取500 μL組織勻漿接種于MEF細(xì)胞上，置于37 ℃、 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附1 h后棄去組織勻漿，加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)7 d，每日觀察是否出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，以明確病毒分離是否陽性。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測MCMV M112-113/E1蛋白：石蠟切片浸泡于二甲苯中進(jìn)行脫蠟，而后用100%、90%和70%系列不同梯度乙醇水化后進(jìn)行抗原修復(fù)，消除內(nèi)源性過氧化物酶，室溫條件下用1% BSA封閉1 h，滴加一抗Mouse Anti M112-113（MCMV）單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，PBST清洗后滴加二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，HE復(fù)染后，封片鏡檢。

1.3.3 RT-PCR檢測小鼠肝組織內(nèi)MCMV IE及M55基因片段表達(dá)情況：取20 mg肝組織根據(jù)試劑盒說明書提取總RNA，測定RNA濃度，于冰盒上配置反轉(zhuǎn)錄體系。25 μL總體系，上、下游引物（MCMV即刻早期基因IE及晚期基因M55引物序列見表1）各0.5 μL，cDNA 1 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min； 每循環(huán)：94 ℃變性35 s，55 ℃退火35 s，72℃延伸40 s，35循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠120 V電泳30 min，顯影觀察。

1.4 MCMV感染小鼠肝炎模型特點(diǎn)分析

1.4.1 血清肝功能酶學(xué)檢測：麻醉后摘除小鼠眼球取外周血，于37 ℃溫箱中靜置1 h，2 000 r/min離心30 min，分離血清，于全自動生化分析儀中檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）水平。

1.4.2 肝組織HE染色：取實(shí)驗(yàn)小鼠的肝中葉，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色，鏡下觀察并隨機(jī)選取3個非重疊視野進(jìn)行病理學(xué)評分，根據(jù)臨床病毒性肝炎組織病理常用評分系統(tǒng)之一Ishak評分系統(tǒng)進(jìn)行定量評估[17]。

1.4.3 RT-qPCR檢測實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平：RNA提取及反轉(zhuǎn)錄條件同上1.3.3，RT-qPCR反應(yīng)為20 μL體系，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 1 μL，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS23.0及Graphpad 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料使用±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量資料的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒滴度檢測結(jié)果 空斑形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞對照孔細(xì)胞單層完整，染色均勻，不同稀釋倍數(shù)下空斑數(shù)量呈現(xiàn)近似線性分布。鏡下觀察空斑中央MEF裂解死亡，邊緣細(xì)胞腫脹變圓，空斑周邊正常細(xì)胞呈長梭形仍保持正常的成纖維細(xì)胞形態(tài)（見圖1）。經(jīng)計(jì)算MCMV滴度為6.5×106PFU/mL。

圖1 空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測MCMV滴度結(jié)果（結(jié)晶紫染色）

2.2 一般情況 接種病毒后，各實(shí)驗(yàn)組小鼠存活率均為100%，病毒感染組小鼠較陰性對照組小鼠活動減少，進(jìn)食及飲水量減少，體質(zhì)量下降，以病毒感染后第3和第4天下降最為顯著（P＜0.05），而后趨于緩慢的增長，陰性對照組小鼠一般狀況良好，體質(zhì)量呈穩(wěn)定增長（見圖2）。

圖2 2組小鼠體質(zhì)量變化曲線

2.3 肝組織整體外觀變化及肝指數(shù) 肝臟外觀對比可見，陰性對照組小鼠肝臟呈棕紅色、光滑，邊緣銳利，質(zhì)地較軟，肝指數(shù)為（4.43±0.47）%；病毒感染組小鼠感染后第3天肝臟出現(xiàn)充血，輕微腫脹，邊緣稍圓鈍，肝指數(shù)為（5.87±0.51）%，較陰性對照組明顯升高（P＜0.05）。感染后第7天，肝臟出現(xiàn)明顯腫大，邊緣圓鈍且表面呈顆粒樣改變，肝指數(shù)為（6.87±0.31）%，較陰性對照組[（5.00± 0.47）%]仍保持較高水平（P＜0.05），見圖3。

圖3 2組小鼠代表性肝臟外觀圖及肝指數(shù)定量分析結(jié)果

2.4 血清ALT和AST檢測結(jié)果 肝功能檢測結(jié)果顯示，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動物血液生理生化參考手冊》[18]，陰性對照組小鼠肝功能指標(biāo)ALT[（27.0±5.0）U/L] 及AST[（126.0±16.17）U/L]均在正常參考值范圍 內(nèi)[ALT（23.58～49.30 U/L），AST（122.16～ 235.17 U/L）]，病毒感染組于感染后第3天ALT [（103.0±28.618）U/L]及AST[（253.0± 12.530）U/L]明顯升高（P＜0.01），呈現(xiàn)急性肝損害；感染后第7天基本恢復(fù)正常，見圖4。

圖4 感染后第3天及第7天2組小鼠血清ALT及AST檢測結(jié)果

2.5 肝組織病理結(jié)果 肝組織HE染色結(jié)果顯示，陰性對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞完整，圍繞中央靜脈大致呈放射狀排列。病毒感染組感染后第3天肝組織HE染色結(jié)果可見肝細(xì)胞呈氣球樣變，肝細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)局灶性的炎性細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞點(diǎn)灶狀壞死，匯管區(qū)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤，以感染后的第3天最為顯著，該現(xiàn)象持續(xù)至感染后第7天。感染后第3天及第7天病毒感染組Ishak評分分別為（6.22±1.39）和（3.67±0.71），較陰性對照組（1.33±0.71）和（1.10±0.45）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），出現(xiàn)明顯的急性病毒性肝炎病理改變，見圖5。

圖5 感染后第3天和第7天2組小鼠肝組織HE染色結(jié)果及定量分析結(jié)果

2.6 肝組織病毒分離結(jié)果 病毒檢測結(jié)果顯示，陰性對照組小鼠肝組織病毒分離陰性；感染后第3天及第7天病毒感染組小鼠肝組織病毒分離培養(yǎng)物于接種后96 h，細(xì)胞首先出現(xiàn)局灶性腫脹變圓、細(xì)胞內(nèi)顆粒增多、折光性增強(qiáng)等現(xiàn)象，繼而病變區(qū)域及病變部位變大變多，最終出現(xiàn)細(xì)胞聚集后脫落，表現(xiàn)出明顯CPE，病毒分離結(jié)果陽性（見圖6A）。病毒分離培養(yǎng)物經(jīng)測序，測序峰圖未見套峰、雜峰，經(jīng)Genbank比對匹配度達(dá)95%以上，明確為MCMV（見圖6B）。

圖6 肝組織病毒分離培養(yǎng)及測序結(jié)果

2.7 實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 通過免疫組化檢測小鼠肝組織內(nèi)MCMV特異的M112-113/E1蛋白，可見感染后第3天和第7天病毒感染組小鼠肝組織MCMV M112-113/E1蛋白陽性的信號散在分布，主要出現(xiàn)在細(xì)胞核，見圖7。

圖7 感染后第3天和第7天病毒感染組小鼠肝臟免疫組織化學(xué)結(jié)果

2.8 病毒感染組小鼠肝組織內(nèi)MCMV IE1及M55基因片段檢測結(jié)果 RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒感染后第3天病毒感染組小鼠肝組織內(nèi)MCMV IE基因及M55基因片段檢測結(jié)果均為陽性，證明病毒感染組小鼠肝組織內(nèi)病毒處于活動性感染階段。感染后第7天實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織MCMV IE基因檢測仍陽性，M55基因檢測陰性，仍存在MCMV感染。見圖8。

圖8 病毒感染組小鼠肝組織內(nèi)MCMV IE及M55基因DNA片段檢測結(jié)果

2.9 實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織炎性細(xì)胞因子檢測結(jié)果 通過qRT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)病毒感染后，IL-1β于感染后第7天較陰性對照組顯著上升（P＜0.01）；TNF-α于感染后第3天較陰性對照組明顯上升，并在感染后第7天上升更為顯著（P＜0.01）；IL-6同樣在病毒感染后的第3天出現(xiàn)顯著上升（P＜0.01），而后第7天出現(xiàn)下降（P＜0.05），表明MCMV感染肝炎情況下炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯上調(diào)。見圖9。

圖9 實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果

3 討論

CMV屬于單純皰疹病毒β亞科[19]，存在嚴(yán)格的種屬特異性，因此對其研究存在一定的局限，而HCMV和MCMV有許多遺傳上的相似之處，有多個同源基因，包括結(jié)構(gòu)基因和免疫逃避基因[20]。FISHER等[9]研究表明，MCMV感染小鼠模型能夠模擬除外先天性感染的多種疾病模型。既往有實(shí)驗(yàn)利用BALB/c小鼠建立MCMV全身感染模型，分析了全身感染時炎癥及免疫應(yīng)答的情況，表明BALB/c小鼠對MCMV易感，并且由于BALB/c小鼠黑色素瘤缺失基因2 （absent in melanoma, AIM2）炎性小體活化時間短，導(dǎo)致其感染后易呈現(xiàn)慢性化，肝臟直至感染后第28天仍可見炎性細(xì)胞浸潤[21]。現(xiàn)階段關(guān)于MCMV感染的小鼠模型僅限于野生型BALB/c小鼠，國內(nèi)外關(guān)于其他品系小鼠與MCMV感染的研究鮮有報(bào)道。目前基因編輯小鼠多基于C57BL/6小鼠背景，因此有必要建立C57BL/6小鼠感染MCMV相關(guān)疾病模型。通過構(gòu)建MCMV感染C57BL/6小鼠急性肝炎模型，分析其感染特點(diǎn)，為該模型在抗CMV藥物研究中的應(yīng)用奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究采用組織細(xì)胞培養(yǎng)的方式擴(kuò)增病毒，將1.0×106PFU病毒懸液經(jīng)腹腔注射感染C57BL/6小鼠。病毒感染組肝組織出現(xiàn)的改變及感染特點(diǎn)：感染后第3天肝組織RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCMV IE基因與M55基因均為陽性，而第7天IE基因陽性，M55轉(zhuǎn)為陰性，第3天血清ALT及AST明顯升高，第7天趨于正常水平；第3天起肝組織出現(xiàn)充血及腫大，病理學(xué)上第3天肝組織出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞點(diǎn)灶性壞死，第7天炎癥緩解，但仍可見炎性細(xì)胞浸潤；第3天及第7天肝組織免疫化學(xué)染色可見特性性MCMV M112-113/E1蛋白表達(dá)；肝組織勻漿病毒分離陽性，測序?yàn)镸CMV。肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平明顯升高，第3天起促炎細(xì)胞因子IL-6及TNF-α明顯上調(diào)，第7天IL-1β出現(xiàn)顯著上調(diào)。

以上研究結(jié)果表明以1.0×106PFU的病毒懸液經(jīng)腹腔注射的方式感染C57BL/6小鼠急性肝炎模型以第3天最為顯著，此時肝臟損害最為嚴(yán)重，且肝組織內(nèi)病毒處于復(fù)制增殖及活動性感染狀態(tài)，而后急性肝炎損害趨于好轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)氨酶水平恢復(fù)正常，HE染色結(jié)果肝細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤情況減輕，病毒活動性感染的M55基因檢測陰性，而IE基因仍為陽性，表明感染后第7天起仍存在病毒感染，但感染趨于進(jìn)入潛伏感染狀態(tài)。不同小鼠品系對MCMV感染的免疫效應(yīng)機(jī)制不同，例如，BALB/c、BALB.B、B10.D2、B10.A和A/J品系小鼠對MCMV易感；C57BL/10對MCMV中度抵抗。既往劉志峰等[22]構(gòu)建BALB/c小鼠感染MCMV模型可用于14 d內(nèi)急性感染，而本研究C57BL/6小鼠感染MCMV模型7 d內(nèi)有效，其機(jī)制可能為C57BL/6小鼠有高活性的自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells, NKs），在C57BL/6小鼠中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種基因控制的先天宿主對MCMV的抗性機(jī)制，包括Cmv1、Cmv2、Cmv3和Cmv4，其遺傳位點(diǎn)Cmv1編碼NK細(xì)胞受體Ly49H，激活NK細(xì)胞應(yīng)答，從而使MCMV感染病程相對較短[16]。

綜上，MCMV感染C57BL/6小鼠急性肝炎模型成功建立，可用于7 d內(nèi)短期的藥物研究，該模型能夠?yàn)檫M(jìn)一步研究HCMV感染肝炎的發(fā)病機(jī)制及探索新的生物學(xué)治療方式提供基礎(chǔ)依據(jù)。