傅揚(yáng)揚(yáng),黃曉穎,王良興
溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,浙江 溫州 325015
肺癌是一種最常見的惡性腫瘤,其病死率在腫瘤中位居第一[1]。近年來,分子靶向治療和免疫治療明顯改善了腫瘤患者的預(yù)后,但肺癌的5年生存率仍然只有22%[2]。因此,發(fā)現(xiàn)新的腫瘤相關(guān)基因和治療靶點(diǎn)對肺癌的診斷和治療具有重要的意義。A激酶錨定蛋白9(A kinase anchoring protein 9, AKAP9)是一種參與微管成核的高爾基體/中心體支架蛋白[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),AKAP9參與了結(jié)直腸 癌[5]、甲狀腺癌[6]、乳腺癌[7]、急性髓系白血病[8]的發(fā)生或轉(zhuǎn)移。在一項(xiàng)大規(guī)模的肺癌相關(guān)全基因組篩查中,AKAP9被發(fā)現(xiàn)是潛在的易感基因[9]。在前期的研究中,我們通過Kaplan-Meier plotter平臺(tái)分析AKAP9的表達(dá)水平與肺癌預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AKAP9表達(dá)高的患者生存時(shí)間明顯縮短。然而,AKAP9在肺腺癌細(xì)胞中的確切作用尚未明了,因此本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探討AKAP9對肺腺癌細(xì)胞A549增殖和遷移的作用,并進(jìn)一步闡明其可能的分子機(jī)制。
1.1 材料
1.1.1 細(xì)胞:肺腺癌細(xì)胞A549購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。
1.1.2 主要試劑:shRNA購自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司;MTT試劑購自美國Sigma-Aldrich公司;SYBR Green購自天根生化科技(北京)有限公司;MLV-reverse transcriptase試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司;細(xì)胞周期試劑盒購自美國BD Pharmingen公司;AKAP9抗體購自美國Santa Cruz公司;P27、細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)、細(xì)胞周期素依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、磷酸化EGFR(p- EGFR)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal- regulated kinase, ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)、β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):A549在含有10%胎牛血清的F12K完全培養(yǎng)基中,放置在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每3天更換1次新鮮培養(yǎng)基。
1.2.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RTqPCR)檢測目的基因mRNA表達(dá)量:提取肺腺癌細(xì)胞的總RNA,利用MLV-reverse transcriptase試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后用RealMssterMix(SYBR Green)試劑盒進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng),GAPDH基因作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△Ct相對定量分析法,并以GAPDH基因作為內(nèi)參基因來計(jì)算轉(zhuǎn)錄的相對差異。AKAP9引物序列為F:5’-ACTCAAGGCACAGCATAAA CAC-3’,R:5’-GTTCTTCACTGCGTCCCAA-3’。GAPDH引物序列為F:5’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’,R:5’-GACA AGCTTCCCGTTCTCAG-3’。
1.2.3 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和ERK通路相關(guān)蛋白的表達(dá):利用 Bradford法檢測蛋白濃度,等量的蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。PVDF膜用5%牛奶封閉2 h,隨后一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育2 h。蛋白條帶用ECL系統(tǒng)進(jìn)行檢測。
1.2.4 shRNA感染實(shí)驗(yàn):特異性shRNA及陰性對照shRNA由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司合成。取1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板,根據(jù)細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)值感染相應(yīng)的病毒量,利用Western blot、RTqPCR檢測敲減效率。經(jīng)敲減處理后的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。病毒感染細(xì)胞的兩個(gè)靶點(diǎn)序列為shAKAP9 1#:GAAUAUUGAUGGUACAAUATT,shAKAP9 2#:GCACA AUAAUUAUUGAAUUTT。
1.2.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖:以每孔3 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板,設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)1、3、5 d后,加入MTT溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,加入DMSO融解紫色結(jié)晶產(chǎn)物,用分光光度計(jì)于570 nm處讀取吸收光值。
1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力:以每孔1 000個(gè)細(xì)胞接種于6孔板,設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基,細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)10~12 d,甲醛固定后用0.5%結(jié)晶紫溶液對細(xì)胞進(jìn)行染色,拍照并計(jì)算克隆形成數(shù)目。
1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期:取1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板,次日用慢病毒感染,置于孵箱培養(yǎng)96 h后離心收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用PBS洗滌2次后,用冰冷的70%乙醇固定,-20 ℃存儲(chǔ)過夜。離心并用PBS洗滌后,細(xì)胞沉淀重懸于500 mL含50 mg/mL 碘化丙啶,0.1 mg/mL RNase A,0.05% Triton X-100的PBS中,室溫下避光孵育15 min。細(xì)胞周期用Becton Dickinson FACS Caliburr進(jìn)行檢測。
1.2.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移:將含5×104個(gè)肺腺癌細(xì)胞A549的100 μL無血清培養(yǎng)基加入上室,下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,放置培養(yǎng)箱中孵育。24 h后,用甲醇固定細(xì)胞,0.1%結(jié)晶紫染色,棉簽拭去上室細(xì)胞,顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 AKAP9對肺腺癌細(xì)胞A549增殖的影響 利用針對兩個(gè)不同靶點(diǎn)的shRNA感染肺腺癌細(xì)胞A549,RTqPCR結(jié)果顯示,shAKAP9 1#組(0.221±0.043)和shAKAP9 2#組(0.331±0.034)AKAP9 mRNA的表達(dá)水平與shNC組(1.00±0.049)比較顯著降低(P<0.01),見圖1A。Western blot結(jié)果顯示,相較shNC組(1.00±0.033),shAKAP9 1#組(0.387±0.037)和shAKAP9 2#組(0.52±0.025)AKAP9蛋白水平明顯下降(P<0.01),見圖1B。MTT結(jié)果顯示,從第3天開始,shAKAP9 1#組(0.383±0.048)和shAKAP9 2# 組(0.405±0.057)細(xì)胞數(shù)目較shNC組(0.765± 0.016)顯著減少(P<0.01),見圖1C??寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相較shNC組(190.667±26.652),shAKAP9 1#組(14.333±6.658)和shAKAP9 2#組(50.333±4.163)克隆形成能力明顯減弱(P<0.01),見圖1D、圖1E。
圖1 沉默AKAP9對肺腺癌細(xì)胞A549增殖的影響
2.2 AKAP9對肺腺癌細(xì)胞A549遷移的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相較shNC組(319.8± 22.039),shAKAP9 1#組(123.8±14.618)和shAKAP9 2#組(164.2±9.338)遷移細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.01),見圖2。
圖2 沉默AKAP9對肺腺癌細(xì)胞A549遷移的影響
2.3 AKAP9對肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,相較shNC組(59.7±0.854)%,shAKAP9 1#組(70.2±0.557)%和shAKAP9 2#組(65.9±0.625)%細(xì)胞停滯在G1期顯著增加(P<0.01),見圖3A、圖3B。同時(shí),細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控基因P27表達(dá)增加,正性調(diào)控基因Cyclin D1和CDK4表達(dá)減少,見圖3C、圖3D。
圖3 沉默AKAP9對A549細(xì)胞周期的影響
2.4 AKAP9對ERK通路的影響 Western blot結(jié)果顯示,相較shNC組,沉默AKAP9組EGFR和其下游基因ERK的磷酸化水平明顯降低(見圖4)。
圖4 沉默AKAP9對ERK通路的影響
AKAP9是一種蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)錨定蛋白,它位于染色體7q21,富含coilcoil結(jié)構(gòu),可與激酶或磷酸酶相互作用,從而介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路傳導(dǎo)[10]。AKAP9與CDK5RAP2、 Myomegalin、磷酸二酯酶4D、PKA等蛋白在高爾基體和中心體上形成一個(gè)復(fù)合體,來調(diào)節(jié)微管的形成和肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)變化[11-13],進(jìn)而參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化和細(xì)胞動(dòng)力等過程。研究報(bào)道,在結(jié)直腸癌細(xì)胞中,AKAP9可以與細(xì)胞分裂周期因子42相互作用蛋白4結(jié)合促進(jìn)腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14];在急性髓系白血病中,AKAP9可通過Wnt/β-catenin通路促進(jìn)細(xì)胞的干性[8]。
前期研究中,我們通過Kaplan-Meier plotter 平臺(tái)分析AKAP9的表達(dá)水平與肺癌預(yù)后的關(guān)系,以AKAP9表達(dá)水平的中位值為截?cái)嘀担瑢? 925例肺癌患者分為AKAP9高表達(dá)組和AKAP9低表達(dá)組,Kaplan- Meier生存曲線表明AKAP9表達(dá)水平高的肺癌患者預(yù)后更差[HR=1.19(1.05~1.35),P=0.008],提示AKAP9可作為肺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。有研究報(bào)道AKAP9與DNA合成和中心體復(fù)制有關(guān)[15],從而參與細(xì)胞周期進(jìn)程。細(xì)胞周期是一個(gè)受特定細(xì)胞周期素(Cyclins)和細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDKs)嚴(yán)格調(diào)控的步驟。在G1期,Cyclin D和CDK4/6形成復(fù)合體,磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, Rb),使細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換,促進(jìn)細(xì)胞分裂。P27是Cyclin-CDK復(fù)合體活性的抑制劑,可以使Cyclin-CDK復(fù)合體磷酸化Rb的功能失活,從而阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程[16]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默AKAP9可以通過增加P27的表達(dá)以及抑制Cyclin D1和CDK4的表達(dá)來誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞G1-S期阻滯,從而抑制肺癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力。有研究發(fā)現(xiàn),敲減AKAP9可干擾中心體和非中心體的微管成核,促使高爾基體結(jié)構(gòu)破碎,從而抑制T細(xì)胞的遷移[17]。本研究也發(fā)現(xiàn)沉默AKAP9抑制肺腺癌細(xì)胞A549的遷移能力。
ERK通路屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,是影響細(xì)胞增殖最重要的信號(hào)通路,許多關(guān)鍵的生長因子和原癌基因通過該通路發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長的作 用[18]。異常激活ERK通路可促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[19],而且還是肺癌細(xì)胞對藥物產(chǎn)生耐藥性的重要原因[20]。目前,許多針對ERK通路的抑制劑正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)[19]。研究報(bào)道ERK通路激活可增加Cyclin D1表達(dá)水平[16],從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn),沉默AKAP9可以通過抑制ERK通路減少Cyclin D1的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)A549細(xì)胞G1-S期阻滯。EGFR屬于酪氨酸激酶家族,它的生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)上皮組織發(fā)育和穩(wěn)態(tài)[21]。EGFR突變在非小細(xì)胞肺癌基因突變中位居第二,尤其在亞洲非小細(xì)胞肺癌患者中其發(fā)生率高達(dá)50%[22]。異常激活EGFR可以通過傳導(dǎo)下游ERK、AKT、蛋白激酶C等多條通路來促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展[21]。EGFR抑制劑對不適合手術(shù)、EGFR突變的肺腺癌患者具有顯著的治療作用,能延長患者的生存期[23]。本研究發(fā)現(xiàn),沉默AKAP9可以減弱肺腺癌細(xì)胞A549的EGFR和ERK活性,為研究肺腺癌細(xì)胞A549異常增殖和遷移提供了一個(gè)新的分子機(jī)制。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)沉默AKAP9可以通過抑制EGFR和ERK磷酸化,抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移,并誘導(dǎo)G1-S期阻滯;AKAP9可能成為臨床治療肺腺癌的新靶點(diǎn)。