余曉敏，常國林，鄭逸旸，陳誠，唐施藝，吳鑫媛，呂佳，林向陽，朱麗青

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 浙江省檢驗(yàn)診斷及轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 溫州市血液學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325027

遺傳性蛋白C缺陷癥（inherited protein C deficiency, IPCD）是由位于2號(hào)染色體2q13-2q14的蛋白C基因（protein C gene, PROC）突變所引起的常染色體隱性、顯性或不完全顯性遺傳性疾病[1]，全球發(fā)病率約為1/16 000[2]。IPCD的典型臨床癥狀包括血栓性并發(fā)癥、暴發(fā)性紫癜、彌漫性血管內(nèi)凝血和新生兒期繼發(fā)性出血，與PROC突變類型密切相 關(guān)[3]。截至目前，已報(bào)道300多種PROC突變[4]。IPCD可分為兩種類型：I型表現(xiàn)為蛋白C（protein C, PC）抗原水平和功能同時(shí)降低，II型表現(xiàn)為PC功能降低而抗原水平正常，或PC活性遠(yuǎn)低于抗原水平，大多數(shù)IPCD屬于I型缺陷[5]。雖然IPCD于1981年就曾被首次報(bào)道[6]，但其具體致病機(jī)制至今尚未完全明晰。本課題組發(fā)現(xiàn)了1個(gè)由p.Ala333Thr突變引起的I型IPCD家系，家系成員中多位有血栓形成史[7]，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)患者PROC的第9號(hào)外顯子存在c.1084G＞A雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致p.Ala333Thr，但基因突變導(dǎo)致PC含量降低的分子機(jī)制尚不明確。因此，本研究構(gòu)建PC p.Ala333Thr突變型質(zhì)粒，通過體外實(shí)驗(yàn)對PC p.Ala333Thr突變導(dǎo)致IPCD的致病機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 先證者及其家系 先證者及其家系6人均納入研究，隨機(jī)抽取本院100名健康成年人作為對照組，其中男45例，女55例，年齡12～58歲。本研究通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的倫理委員會(huì)審查（倫理批號(hào)：KY2022-R050），且所有受試者均知情并簽署知情同意書。先證者，女，39歲，因雙下肢反復(fù)疼痛前往溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診。既往有下肢深靜脈血栓形成史，長期口服華法林抗凝，家族中父親因腦靜脈竇血栓死亡，哥哥因肺栓塞死亡，家系圖見圖1。入院檢查：PC活性39%，抗核抗體1∶320陽性，下肢血管超聲顯示左小腿深靜脈血栓形成，臨床診斷為“PC缺陷癥，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，下肢深靜脈血栓形成”。

圖1 IPCD家系圖

1.2 人胚胎腎細(xì)胞HEK-293T的培養(yǎng) HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（美國Gibco公司）的DMEM完全培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%～90%時(shí)以1∶5的比例進(jìn)行傳代，傳代后將細(xì)胞置于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，接種后2～3 d即可長成致密單層。

1.3 PC p.Ala333Thr突變體質(zhì)粒的構(gòu)建 在已有野生型質(zhì)粒：pCMV3-SP-N-Flag-PC WT（北京Sino Biological公司，見圖2）的基礎(chǔ)上，采用 QuickMutationTM定點(diǎn)突變試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）構(gòu)建突變體表達(dá)質(zhì)粒：pCMV3-SP-NFlag-PC p.Ala333Thr。挑取多個(gè)克隆進(jìn)行全長測 序，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)定點(diǎn)突變成功引入，且沒有引入其他變異，最后將構(gòu)建成功的突變質(zhì)粒用QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）大規(guī)模抽提，并轉(zhuǎn)染入生長狀態(tài)佳的HEK-293T細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)。所有質(zhì)粒都經(jīng)正、反向測序證實(shí)構(gòu)建成功，質(zhì)粒測序圖譜見圖3。

圖2 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

圖3 PROC第9號(hào)外顯子存在c.1084G＞A雜合錯(cuò)義突變

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分為WT組（轉(zhuǎn)染pCMV3-SP-N-Flag-PC WT質(zhì)粒）和Ala333Thr組（轉(zhuǎn)染pCMV3-SP-N-Flag-PC p.Ala333Thr質(zhì)粒），每組3個(gè)復(fù)孔，按Lipofectamine 2000試劑（美國ThermoFisher公司）說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。將生長狀態(tài)佳的HEK-293T細(xì)胞按5×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加入3 mL無雙抗完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），在37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h至細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別在轉(zhuǎn)染24 h后提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-qPCR分析，轉(zhuǎn)染48 h后提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot分析并收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行ELISA分析。

1.4 RT-qPCR檢測PC轉(zhuǎn)錄水平 使用RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）抽提轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit（日本TaKaRa 公司）配制RT反應(yīng)液，混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用ABI Prism 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國 Applied Biosystems公司），按照兩步法PCR擴(kuò)增程序執(zhí)行，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)RT-qPCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線。采用Ct法比較分析突變型PROC和野生型PROC表達(dá)水平的差異。

1.5 Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)PC表達(dá)水平 提取收集細(xì)胞總蛋白后，通過Western blot法檢測細(xì)胞系中PC表達(dá)量。SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，恒壓電流濃縮膠80 V，分離膠120 V。濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜，冰浴中以300 mA電流轉(zhuǎn)膜90 min。用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。按照說明書標(biāo)示比例加入經(jīng)稀釋的PC抗體（美國Proteintech公司）、GADPH抗體（美國Proteintech公司），4 ℃輕搖過夜。次日，洗膜后按照1∶5 000體積比加入PBST稀釋的兔抗，室溫輕搖1 h。最后將曝光液滴加在條帶上，置于曝光機(jī)內(nèi)曝光，使用軟件Image J分析獲得的條帶。

1.6 ELISA檢測細(xì)胞外PC表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集兩組所有細(xì)胞培養(yǎng)液，用Amicon Ultra-4 10K超濾管將細(xì)胞培養(yǎng)液濃縮10倍。通過ELISA法檢測細(xì)胞外PC表達(dá)水平。按照說明書（上海江萊生物科技有限公司）稀釋標(biāo)準(zhǔn)品至相應(yīng)濃度，在標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣本孔中加入待測樣本50 μL，空白孔中加樣本稀釋液50 μL。除空白孔外加辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體100 μL/孔，封板后置于37 ℃溫育60 min。洗滌液重復(fù)洗板5次后加入底物A，B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min后加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定OD值。計(jì)算所得的樣本濃度，除以濃縮倍數(shù)即WT組和Ala333Thr組PC的細(xì)胞外濃度。

1.7 PC及細(xì)胞器免疫熒光染色 鋪Ф35 mm共聚焦專用皿，每皿接種5×104個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。一抗使用3% BSA配制PC兔多抗（1∶500），二抗使用3% BSA配制抗兔FITC抗體（1∶200）。按照說明書分別配制ER Tracker Red工作液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）（1∶2 000）和Golgi Tracker Red工作液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）（1∶800），室溫下避光孵育1 h吸走所有工作液，使用PBS清洗3次。在熒光顯微鏡下觀察PC在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum, ER）和高爾基體（Golgi apparatus, GA）中的分布情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析 PolyPhen-2是用于預(yù)測氨基酸替代對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能影響的軟件，通過給出預(yù)測分值量化評估突變類型的有害性，該值越接近1則表示突變造成的危險(xiǎn)性越高，PolyPhen-2對先證者PC的突變類型危害程度評分為0.763，因而，預(yù)測p.Ala333Thr有害性為高。此外，我們利用多序列在線比對工具T-Coffee對PC的第333位氨基酸在同源物種間的保守性進(jìn)行評估，顯示該位點(diǎn)保守性不高，見圖4。

圖4 PC第333位氨基酸保守性分析結(jié)果

2.2 PC p.Ala333Thr突變體轉(zhuǎn)錄水平和細(xì)胞內(nèi)外蛋白水平變化 RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后，PC WT和PC Ala333ThrPROCmRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.120），表明PC Ala333Thr突變體在轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生明顯變化（見圖5A）。Western blot結(jié)果顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后PC WT和PC Ala333Thr的PC蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020），表明PC Ala333Thr突變體在HEK-293T細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量明顯降低（見圖5B）。轉(zhuǎn)染48 h后，收集培養(yǎng)細(xì)胞的上清液，通過ELISA檢測上清液中PC含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示p.Ala333Thr突變體的PC水平為60%±27.4%，明顯低于WT組，這與I型IPCD的臨床表型一致（見圖5C）。

圖5 PC p.Ala333Thr突變體轉(zhuǎn)錄水平和細(xì)胞內(nèi)外蛋白水平變化

2.3 PC p.Ala333Thr突變體在ER和GA中含量的變化 我們將野生型PC質(zhì)粒和p.Ala333Thr突變PC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的HEK-293T細(xì)胞分別用ER和GA的熒光染料進(jìn)行染色。染料可以使相應(yīng)的細(xì)胞器在激光共聚焦顯微鏡下經(jīng)594 nm激光激發(fā)紅色熒光，而經(jīng)染色的PC經(jīng)488 nm激光激發(fā)綠色熒光，若PC在相應(yīng)細(xì)胞器內(nèi)，則兩種顏色重疊顯黃色熒光。結(jié)果顯示，野生型PC除在ER分布外，在GA內(nèi)也大量存在；突變蛋白主要分布在ER，少量進(jìn)入GA內(nèi)，見圖6。

圖6 野生型PC和突變型PC在細(xì)胞器內(nèi)的定位

3 討論

PC是人體重要的抗凝蛋白，在機(jī)體抗凝血功能中發(fā)揮重要作用。PC在凝血酶或凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物的催化下，轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨鞍證（activated protein C, APC），后者與輔因子蛋白S（protein S, PS）結(jié)合后，通過多種機(jī)制發(fā)揮抗凝血作用[8]。PC缺乏可引起靜脈血栓栓塞、暴發(fā)性紫癜、彌散性血管內(nèi)凝血等。

IPCD是由2號(hào)染色體長臂（2q13-14）上的PC基因突變引起[9]，多為常染色體顯性遺傳，嚴(yán)重的PC缺陷與純合性或復(fù)合雜合性突變有關(guān)，最終通過影響mRNA的正常序列和蛋白質(zhì)合成導(dǎo)致IPCD[10]。在我們的研究中，先證者及其家系發(fā)生PC p.Ala333Thr 突變，導(dǎo)致IPCD發(fā)生，引起機(jī)體靜脈血栓栓塞等多種疾病。

本研究成功構(gòu)建了PC p.Ala333Thr突變的質(zhì)粒，經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致PC表達(dá)量相對下降，該結(jié)論與臨床結(jié)果相符合[7]。因此認(rèn)為患者PROC的p.Ala333Thr突變導(dǎo)致PC含量偏低。為探討p.Ala333Thr突變位點(diǎn)對PC結(jié)構(gòu)和功能的影響，我們通過PolyPhen-2軟件對p.Ala333Thr突變進(jìn)行評估，評分結(jié)果為0.763分，評估有害性高，提示該突變可能影響到PC的結(jié)構(gòu)和功能。為進(jìn)一步分析p.Ala333Thr突變引起的IPCD的分子致病機(jī)制，本研究用野生型質(zhì)粒和p.Ala333Thr突變型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示，p.Ala333Thr突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞PC mRNA轉(zhuǎn)錄水平與野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞PC mRNA相比沒有明顯差別，說明該位點(diǎn)的突變并沒有導(dǎo)致PROC基因在轉(zhuǎn)錄水平的下降，而Western blot和ELISA結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的PC都出現(xiàn)顯著降低，因此，蛋白表達(dá)量的下降原因可能發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器對蛋白質(zhì)進(jìn)行加工、轉(zhuǎn)運(yùn)等過程中。我們選擇了在細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)加工、轉(zhuǎn)運(yùn)和篩選的兩種主要細(xì)胞器ER和GA，進(jìn)行免疫熒光染色。免疫熒光染色結(jié)果顯示，PC p.Ala333Thr突變體在ER中的含量變化不明顯，而在GA內(nèi)突變體含量相對野生型明顯下降。因此我們推測PROC的p.Ala333Thr突變可能導(dǎo)致其翻譯或PC轉(zhuǎn)運(yùn)過程受損。

ER是一種連接細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的細(xì)胞器，在生物合成、折疊、穩(wěn)定、分泌和跨膜蛋白運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。值得重視的是，蛋白質(zhì)的折疊和組裝過程很容易發(fā)生錯(cuò)誤，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，引起蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡[11]。為了維持穩(wěn)定，ER通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)或溶酶體來篩選和清除部分錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，稱之為ER相關(guān)降解或ER吞 噬[12-13]。在本研究中，PROC發(fā)生了p.Ala333Thr位點(diǎn)的突變，該突變可能導(dǎo)致PC的折疊與組裝發(fā)生錯(cuò)誤，從而引發(fā)PC在ER內(nèi)被降解，不能順利運(yùn)輸入GA內(nèi)。

GA是細(xì)胞內(nèi)中心的膜結(jié)合細(xì)胞器，在分泌蛋白及脂類的運(yùn)輸、加工和分類中起關(guān)鍵作用[14]。錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)可脫離ER而被運(yùn)輸?shù)紾A，由GA對其進(jìn)行識(shí)別，由溶酶體靶向降解[15]。在本研究中，免疫熒光結(jié)果顯示，PC p.Ala333Thr突變體在GA內(nèi)的含量明顯下降，證實(shí)了PC突變體含量的下降是在ER向GA運(yùn)輸?shù)倪^程中發(fā)生的。

綜上所述，本研究證實(shí)PC p.Ala333Thr突變造成PC表達(dá)量的下降，從而引發(fā)IPCD。通過體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)，我們推測：PC表達(dá)量下降的關(guān)鍵分子機(jī)制在于p.Ala333Thr位點(diǎn)突變造成PC發(fā)生了折疊錯(cuò)誤，從而在ER內(nèi)被分選并促使錯(cuò)誤折疊的PC被降解或吞噬，阻止其向GA運(yùn)輸，最終導(dǎo)致PC含量的減少。