朱路路 吳旭龍 趙 直 徐冰一 趙心怡 古 聯(lián) 蘇 莉

(1 廣西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，南寧市 530021，電子郵箱:zhululu0714@163.com；2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腦病科，南寧市 530023)

全球疾病負擔數(shù)據(jù)顯示，2019年腦卒中的傷殘調整壽命年為1.43億年，死亡病例數(shù)量達655萬[1]。而缺血性腦卒中是腦卒中的主要類型，占腦卒中病例的77.8%[2]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼轉錄本，lncRNA雖然不能編碼蛋白，但能與DNA、其他RNA、蛋白相互作用而發(fā)揮生物學功能。腦組織和血液中l(wèi)ncRNA表達的變化，可能在缺血性腦卒中的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[3]。lncRNA具有顯著的組織特異性，其功能包括通過順式和反式機制調節(jié)染色質拓撲結構、蛋白質和其他RNA支架，充當?shù)鞍踪|和RNA的誘餌，調節(jié)鄰近基因并產生微肽[4]。目前已有研究初步探討了lncRNA在缺血性腦卒中發(fā)生和發(fā)展中的作用，如MALAT1[5]、PVT1[6]均可通過競爭性抑制微小RNA與靶基因信使RNA的結合,發(fā)揮對微小RNA和靶基因的調控作用,從而參與缺血性腦卒中的病理過程。LINC00342位于染色體2q11.1，為一種lncRNA。目前尚無LINC00342與缺血性腦卒中的相關研究。本研究采用實時熒光定量PCR技術測定急性缺血性腦卒中患者的外周血LINC00342相對表達水平，初步探討外周血LINC00342相對表達水平與急性缺血性腦卒中發(fā)生及患者臨床特征的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入于2015年12月至2019年11月期間在廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院住院診治的90例急性缺血性腦卒中患者作為病例組。納入標準：符合《各類腦血管疾病診斷要點(1995)》[7]中急性缺血性腦卒中的相關診斷標準，且經頭顱CT和/或MRI明確診斷，均由2名主治及以上職稱的神經內科醫(yī)師進行診斷；起病72 h之內入院；患者入院前沒有接受過急性缺血性腦卒中相關治療。排除標準：合并嚴重肝腎功能不全、造血功能障礙、重度休克的患者；由動脈炎、腫瘤、腦外傷、腦血管畸形、藥物等引起的腦卒中患者。選擇同期在廣西南寧市青秀區(qū)2家社區(qū)衛(wèi)生服務中心體檢的90例健康體檢者作為對照組。入選標準：無腦卒中、冠心病等心腦血管疾病病史，無自身免疫性疾病、肝腎功能不全和惡性疾病。病例組中男性43例、女性47例，患者年齡(65.89±11.25)歲；對照組中男性43例、女性47例，年齡(67.23±7.29)歲。兩組年齡、性別分布差異均無統(tǒng)計學意義(t=0.952，P=0.343；χ2=0.000，P=1.000)。本研究已獲廣西中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理委員會審查批準，所有研究對象知情后簽署知情同意書。

1.2 血糖和血脂、血壓指標的檢測 于入院后第2天清晨，采用非抗凝真空采血管采集急性缺血性腦卒中患者清晨空腹血和餐后2 h靜脈血各2 mL，使用日立7600全自動生化分析儀檢測空腹血糖、餐后2 h葡萄糖(2-hour postprandial blood glucose,2hPBG)、總膽固醇、三酰甘油、HDL、LDL、極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)水平。在患者入院時使用電子血壓計測量其血壓水平。

1.3 實時熒光定量PCR檢測外周血LINC00342的相對表達水平 采用含乙二胺四乙酸抗凝劑的真空采血管采集研究對象禁食后次日清晨外周靜脈血5 mL(病例組為入院次日采集)。采用TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司，貨號：15596026)提取血液樣本RNA。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司，貨號：RR047A)將RNA反轉錄成cDNA，嚴格按照說明書步驟操作。目的基因LINC00342和內參基因β-肌動蛋白的引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。LINC00342上游引物序列為5′-AAAAGTCCCCACGAAAACC-3′，下游引物序列為5′-TTCATCCATCTCAACCTCCTC-3′；β-肌動蛋白上游引物序列為 5′-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3′，下游引物序列為5′-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3′。使用TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus，TaKaRa公司，貨號：RR820A)進行PCR反應。反應體系為20 μL，包括10 μL TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)、0.8 μL上游引物、0.8 μL下游引物、0.4 μL ROX Reference Dye、2 μL樣本、6 μL 滅菌水。反應條件如下：預變性，95℃(30 s)；變性，94℃(5 s)；退火、延伸，95℃(15 s)→60℃(34 s)，40個循環(huán)；95℃(15 s)→60℃(1 min)→95℃(15 s)。得到每個樣本對應的目的基因LINC00342和內參基因β-肌動蛋白的Ct值后，以2-ΔCt公式計算LINC00342的相對表達水平。委托生工生物工程(上海)股份有限公司對擴增出的產物進行測序，以驗證該引物序列是否能夠特異性地擴增出目的基因LINC00342序列。

1.4 統(tǒng)計學分析 使用R語言軟件(R 3.6.3版本)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以[M(P25，P75)]表示，組間比較采用秩和檢驗。以P<0.05視為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 病例組和對照組外周血LINC00342相對表達水平的比較 對擴增出的產物進行測序，結果表明本研究設計的產物序列能夠特異性地擴增出LINC00342序列(見圖1)。對照組、病例組的外周血LINC00342相對表達水平分別為0.005(0.003，0.011)、0.003(0.002，0.007)，病例組外周血LINC00342相對表達水平低于對照組(W=3 008.537，P=0.003)。

圖1 LINC00342的PCR產物測序序列圖

2.2 不同外周血LINC00342相對表達水平的急性缺血性腦卒中患者的血壓、血糖、血脂水平的比較 病例組患者外周血LINC00342的相對表達水平不符合正態(tài)分布，以病例組外周血LINC00342的相對表達水平的中位數(shù)(3.07×10-3)為界值，外周血LINC00342相對表達水平≥3.07×10-3為高表達組(n=45)，<3.07×10-3為低表達組(n=45)。結果顯示，LINC00342低表達組患者的2hPBG水平高于LINC00342高表達組(P<0.05)，而兩組的血壓、空腹血糖、血脂水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 不同外周血LINC00342相對表達水平的急性缺血性腦卒中患者的血壓、血糖和血脂水平的比較

組別n總膽固醇[M(P25,P75),mmol/L]三酰甘油[M(P25,P75),mmol/L]HDL[M(P25,P75),mmol/L]LDL[M(P25,P75),mmol/L]VLDL[M(P25,P75),mmol/L]LINC00342高表達組455.25(4.35,5.89)1.65(1.21,2.56)1.12(0.94,1.25)3.28(2.56,3.89)0.77(0.55,1.03)LINC00342低表達組454.89(4.24,5.58)1.30(1.04,1.88)1.10(0.94,1.38)2.96(2.49,3.57)0.60(0.47,0.85) t/W值988.0751 046.501808.541988.5211 078.053P值0.2450.0860.6420.3330.077

3 討 論

近年來，有研究表明lncRNA可通過調節(jié)細胞存活、炎癥反應和血管生成在缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如ANRIL、MALAT1、N1LR、MEG3、H19、C2dat1、FosDT、SNHG14、TUG1[8]。相對于健康對照組，缺血性腦卒中患者的外周血白細胞的ZFAS1表達水平顯著降低[9]，而外周血白細胞的lncRNA-MIAT[10]、血漿淋巴細胞和中性粒細胞的lncRNA-H19表達水平顯著升高[11]。Shen等[12]通過挖掘GSE48060數(shù)據(jù)庫構建lncRNA共表達網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)LINC00342在急性心肌梗死疾病的發(fā)病中起到重要作用。但目前未見有關LINC00342與腦卒中之間的關系的研究。而急性心肌梗死是心肌在冠狀動脈粥樣硬化病變的基礎上發(fā)生缺血缺氧而壞死的疾病[13]，與缺血性腦卒中的病理形成過程(即動脈粥樣硬化基礎上發(fā)生局部腦缺血壞死)相似。因此，我們推測LINC00342與急性缺血性腦卒中的發(fā)病存在一定的關聯(lián)。本研究結果顯示，急性缺血性腦卒中患者外周血的LINC00342相對表達水平低于健康者(P<0.05)。由此可見，LINC00342也可能參與了急性缺血性腦卒中的發(fā)生過程。腦部缺血后，缺血中心區(qū)和在缺血中心區(qū)與正常組織之間的缺血半暗帶成為主要的受損組織，而細胞凋亡是缺血半暗帶細胞死亡的主要形式，可在腦部缺血后數(shù)小時后發(fā)生[14]。LINC00342已被報告與癌癥細胞的凋亡相關。例如，Miao等[15]發(fā)現(xiàn)LINC00342在結腸腺癌組織中過表達，而在結腸腺癌細胞系中敲低LINC00342，可抑制細胞增殖和遷移，并促進細胞凋亡。因此，LINC00342可能通過影響細胞增殖、凋亡，從而參與缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展，但具體機制需要進一步探索。

血糖水平與缺血性腦卒中的發(fā)生有關，高血糖是缺血性腦卒中發(fā)生的危險因素之一[16-17]，高血糖通過酸中毒、活性氧/活性氮、炎癥和線粒體功能障礙4個途徑，增加腦卒中的發(fā)生風險。已有研究表明，lncRNA在一些疾病中調節(jié)了葡萄糖代謝。例如，lncRNA-UCA1通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白-信號轉導和轉錄激活因子3/miR-143-己糖激酶2通路促進癌細胞的葡萄糖消耗和乳酸生成[18]。在膠質瘤中，lncRNA-XIST作為與miR-126競爭的內源性RNA在膠質母細胞瘤細胞中調控胰島素受體底物1/ 磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路，介導細胞增殖和葡萄糖代謝[19]。本研究結果顯示，在急性缺血性腦卒中患者中，低表達組患者的2hPBG水平高于高表達組患者(P<0.05)，提示LINC00342的相對表達水平可能影響急性缺血性腦卒中患者的血糖代謝，這又可能進一步使患者病情惡化。

總之，急性缺血性腦卒中患者的外周血LINC00342相對表達水平下調，外周血LINC00342的相對表達水平可能影響急性缺血性腦卒中的發(fā)生和患者機體的血糖代謝。今后，有必要進一步探索LINC00342影響缺血性腦卒中發(fā)生、發(fā)展的生物學功能和分子機制，為該病的診治提供新的靶點。