彭 昭，吳 娜，牛志濤，高會斌，李 多

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 張家口 075000)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)，是一種反復(fù)發(fā)作、緩解與活動交替的慢性結(jié)腸炎癥，長期罹患可增加結(jié)腸癌患病風(fēng)險[1]。亞洲人群發(fā)病率為3～15例/10萬，且發(fā)病率逐年升高[2]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在UC的發(fā)病和黏膜不可逆性損傷中具有重要作用，減少氧化應(yīng)激和增加抗氧化作用可能是一種有效治療UC方法?？ňS地洛能降低消化性潰瘍大鼠胃液分泌。我們擬使用乙酸(acetic acid，AA)誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，給予卡維地洛干預(yù)，探討其抗氧化機(jī)制，以期為UC治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取30只12周齡雄性大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，體質(zhì)量250～280 g，實(shí)驗(yàn)條件為室溫24～25℃，濕度55%，晝夜節(jié)律為12 h光照/黑暗。自由飲水和自由進(jìn)食鼠糧。實(shí)驗(yàn)中所有步驟均符合動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會要求，獲得動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

30只大鼠隨機(jī)分成5組，每組6只，分組:①空白對照組(Cont)；②乙酸處理組(AA)；③卡維地洛預(yù)處理組(CarV)，使用卡維地洛30 mg·kg-11次·d-1灌胃預(yù)處理；④卡維地洛治療組(CarV+AA)，使用卡維地洛30 mg·kg-11次·d-1灌胃對UC大鼠干預(yù)；⑤美沙拉嗪治療組(MES+AA)，使用美沙拉嗪100 mg·kg-11次·d-1灌胃對UC大鼠干預(yù)。建構(gòu)UC大鼠模型后，所有治療組均進(jìn)行7 d治療，其他組使用等量鹽水替代，然后斷頭處死大鼠，取結(jié)腸組織5～6 cm，生理鹽水沖洗并稱重，取1 cm結(jié)腸組織固定于4%甲醛溶液用于組織病理學(xué)檢查，余下結(jié)腸組織-80℃冰箱保存待用。

1.2.1 UC大鼠造模

根據(jù)Mousavizadeh提供的實(shí)驗(yàn)方法[3]，將大鼠以3%戊巴比妥腹腔麻醉(40 mg·kg-1)，取頭低位尾高位，使用直徑為2.7 mm的聚丙乙烯導(dǎo)管經(jīng)肛門緩慢插入結(jié)腸4 cm并注入5%AA 4 mL，給藥后水平放置2 min，防止漏液。每日評估大鼠疾病活動指數(shù)，DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便粘稠度+便血程度)/3，DAI值大于3為造模成功，記錄造模時間。造模成功后開始進(jìn)行藥物干預(yù)。Cont、CarV組使用等體積生理鹽水進(jìn)行同樣操作。

1.2.2 結(jié)腸黏液含量測定

取1 cm大鼠結(jié)腸組織稱濕重后將其浸泡于1%阿爾新藍(lán)溶液(pH 5.0)24 h，然后將其撈出，0.16 mol·L-1蔗糖溶液沖洗多余染料，0.5 mol·L-1MgCl2溶液提取結(jié)腸壁黏液絡(luò)合染料。將藍(lán)色提取液與乙醚按1∶1比例混合搖勻后，4 000 rpm離心10 min，取上清液置于分光光度計在波長為580 nm處測定吸光度。計算濕結(jié)腸提取阿爾新藍(lán)的量(μg·mg-1)。

1.2.3 結(jié)腸中炎癥因子測定

使用雙抗體夾心ELISA法檢測炎癥因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)水平，方法：取結(jié)腸組織1 cm，4 ℃預(yù)冷PBS漂去組織血漬，濾紙吸干殘留PBS，稱重，加入裂解液勻漿(在冰上)，將得到的勻漿液用液氮反復(fù)凍融3次，室溫靜置30 min，4 ℃ 15 000 rpm離心1 h，取上清嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行檢測，以pg·mg-1蛋白計量。一氧化氮(NO)采用硝酸還原酶法測定：取結(jié)腸組織100 mg，按照重量比1∶9加入生理鹽水進(jìn)行組織勻漿，將得到的勻漿液用液氮反復(fù)凍融3次，室溫靜置30 min，4 000 rpm離心30 min后取上清0.5 mL嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行檢測，NO以mmol·g-1蛋白計量。

1.2.4 結(jié)腸組織中脂質(zhì)過氧化物(LPO)測定

自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為丙二醛，可引起蛋白質(zhì)、核酸等大分子交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性，可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化速率和強(qiáng)度，也能間接反映組織過氧化損傷程度。采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)測定結(jié)腸組織中LPO代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量。取大鼠結(jié)腸組織500 mg，液氮凍存后碾成粉狀，0 ℃加入裂解液500 μL，強(qiáng)力震蕩5 s，4 ℃ 6 000 rpm離心10 min后取上清10 μL，加入工作液后60 ℃恒溫孵育60 min，冷卻后，用分光光度法在532 nm處測定上清液的吸光度。結(jié)果以nmol·mg-1蛋白計量。

1.2.5 結(jié)腸組織的病理學(xué)評估

結(jié)腸組織橫切面用10%甲醛溶液固定，電腦生物包埋機(jī)自動進(jìn)行脫水、透明程序；蠟塊包埋，按照厚度4 μm切片，脫蠟至水，樣本HE染色，2名病理醫(yī)師觀察。主要觀察黏膜形態(tài)，包括黏膜潰瘍、充血、壞死、水腫、細(xì)胞浸潤和杯狀細(xì)胞增生等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸濕重及黏液含量比較

CarV組與Cont組結(jié)腸濕重及黏液含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，AA組大鼠結(jié)腸平均濕重(mg·cm-1)明顯高于Cont組(P<0.01)，Carv+AA組和MES+AA組大鼠結(jié)腸平均濕重明顯低于AA組(P<0.01)(圖1A)。與Cont組相比，AA組大鼠結(jié)腸黏液含量減少(P<0.01)，Carv+AA組、MES+AA組大鼠結(jié)腸黏液含量高于AA組(P<0.01)(圖1B)。

注：組間比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001；a表示與Cont組比較，b表示與AA組比較。

2.2 卡維地洛對UC大鼠結(jié)腸黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2、NO的影響

給藥24 h后，AA組結(jié)腸組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平較Cont組升高(P均<0.01)，Carv+AA組較AA組減低(P<0.01，P<0.05，P<0.01)(圖2 A～C)。AA組結(jié)腸中PGE2水平和NO水平較Cont組均升高(P<0.01，P<0.05)；與AA組相比，Carv+AA組PGE2和NO水平顯著降低(P均<0.05)(圖2 D～E)。

注：組間比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001；a表示與Cont組比較，b表示與AA組比較。

2.3 卡維地洛對UC大鼠結(jié)腸黏膜MDA水平的影響

AA組MDA水平較Cont組明顯升高(P<0.01)，MES+AA組MDA水平較AA組明顯減低(P<0.01)，CarV+AA組MDA水平較AA組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

注：組間比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001；a表示與Cont組比較，b表示與AA組比較。

2.4 卡維地洛對UC大鼠腸黏膜病理改變的影響

光鏡下對大鼠結(jié)腸橫截面進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，Cont組大鼠黏膜未見壞死及炎癥浸潤。AA組可見彌漫性壞死、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞為主，伴有杯狀細(xì)胞增生。Carv+AA組可見上皮細(xì)胞輕度愈合，伴中度壞死和炎癥，杯狀細(xì)胞較AA組減少。MES+AA組較AA組腸道黏膜明顯愈合和改善，較CarV+AA組改善更為明顯(表1)。

表1 卡維地洛對UC大鼠腸黏膜病理改變的影響

3 討 論

已知多種免疫、遺傳和環(huán)境因素均參與UC的發(fā)病和進(jìn)展，主要臨床表現(xiàn)有黏液膿血便、發(fā)熱及體質(zhì)量減輕，病理學(xué)改變?yōu)槟c黏膜腺窩內(nèi)炎性滲出增加。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可共同導(dǎo)致中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基，引起UC發(fā)病和黏膜不可逆性損傷。在UC模型中，循環(huán)吞噬系統(tǒng)內(nèi)可檢測到大量活性氧簇(ROS)[4]，可能引起炎癥和免疫反應(yīng)，直接或間接損害腸上皮細(xì)胞，啟動炎癥信號級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致結(jié)腸黏膜完整性受損，從而引發(fā)UC[5]。在IBD中，促炎細(xì)胞因子水平升高在影響疾病嚴(yán)重程度中起關(guān)鍵作用[6]。ROS和活性氮(RNS)產(chǎn)生過量可導(dǎo)致LPO增加，組織蛋白變性，核酸序列突變[7]。LPO作為氧化應(yīng)激產(chǎn)物可降低細(xì)胞抗氧化能力。減少氧化應(yīng)激和增加抗氧化作用可能是一種有效治療UC方法[8]。

AA誘導(dǎo)的UC大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诓±斫M織學(xué)上與人UC病理改變相似，主要影響遠(yuǎn)端結(jié)腸的非透壁性炎癥，導(dǎo)致黏膜及黏膜下層壞死、水腫、中性粒細(xì)胞浸潤及潰瘍形成。AA質(zhì)子化形式釋放出細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子引起大量細(xì)胞內(nèi)酸化導(dǎo)致自由基產(chǎn)生增加，加重氧化損傷，表現(xiàn)為黏膜損害。本研究采用第三代非選擇性β-腎上腺素受體拮抗劑卡維地洛對UC大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示卡維地洛可有效抵抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)從而達(dá)到保護(hù)結(jié)腸黏膜的目的?？ňS地洛是一種有多重作用的神經(jīng)體液拮抗劑，具有非選擇性β阻滯、α阻滯和抗氧化特性，常用于治療高血壓。近期研究表明其對短暫性腦缺血發(fā)作有神經(jīng)保護(hù)作用；在急性心梗模型中，對心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞均有保護(hù)作用；另外，卡維地洛還可抑制細(xì)胞凋亡、抗炎、保護(hù)線粒體、阻滯鈣離子通道；在心血管缺血和再灌注模型中，卡維地洛還表現(xiàn)出清除自由基，減少LPO產(chǎn)生，通過其抗氧化性對心肌產(chǎn)生保護(hù)作用[9]。在其中發(fā)揮抗氧化作用的是咔唑啉，其抗氧化作用是維生素E的10倍。

氧化應(yīng)激在IBD相關(guān)腸道損傷中增加自由基的產(chǎn)生和抑制內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)起關(guān)鍵作用[10]，可引起受損區(qū)域白細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致腸道屏障完整性受損，包括細(xì)胞因子、花生四烯酸代謝產(chǎn)物等炎癥介質(zhì)釋放，還可導(dǎo)致活性氧簇增加[11]。本研究中，AA增加結(jié)腸濕重與結(jié)腸潰瘍形成、壞死、杯狀細(xì)胞增生、炎癥浸潤相關(guān)。結(jié)腸黏膜屏障功能缺陷是炎癥性腸病特征之一，AA顯著改變了保護(hù)性結(jié)腸黏液的含量[12]，黏液層可增強(qiáng)化學(xué)損傷上皮細(xì)胞修復(fù)[13]。本研究結(jié)果顯示，卡維地洛治療組UC大鼠給藥后增加的結(jié)腸重量減少，病理學(xué)觀察結(jié)腸炎癥減輕；卡維地洛處理后對UC大鼠腸壁黏液也有抑制作用，可能與卡維地洛抗氧化和抗炎作用有關(guān)。有研究表明，卡維地洛可減少酸的分泌，降低LPO產(chǎn)物，增強(qiáng)由壞死引起的抗氧化作用[14]。

促炎介質(zhì)在IBD發(fā)病機(jī)制中起至關(guān)重要的作用，可調(diào)節(jié)黏膜免疫系統(tǒng)，通過中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤改變上皮完整性引起結(jié)腸黏膜損傷。粒細(xì)胞和其他白細(xì)胞遷移到發(fā)炎的黏膜和淺表潰瘍導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子過量產(chǎn)生，相關(guān)研究結(jié)果支持促炎細(xì)胞因子可作為判斷疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)[15]。本研究中，AA組大鼠結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α和IL-6明顯增加，光鏡下見上皮細(xì)胞壞死、水腫、中性粒細(xì)胞浸潤，PGE2和NO水平增加，與相關(guān)研究結(jié)果一致[16]。PGE2和NO水平分別受細(xì)胞酶COX-2和iNOS調(diào)控，而這兩種酶在UC活動期均增高[17]。本研究中，卡維地洛治療組較AA組大鼠結(jié)腸促炎細(xì)胞因子水平顯著降低。有報道卡維地洛在犬慢性缺血模型中具有抗炎和促血管生成作用，卡維地洛可下調(diào)許多炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。

綜上，卡維地洛可降低乙酸誘導(dǎo)的UC大鼠模型腸黏膜損傷，可能因其抗炎作用和抗氧化特性，推測卡維地洛的抗炎作用可能是通過抑制炎癥介質(zhì)和細(xì)胞酶介導(dǎo)的。