張高, 黃楚栓, 褚慶民, 楊柳柳

廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院呼吸科(廣東廣州 510145)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種可防治但發(fā)病率和病死率較高的呼吸系統(tǒng)疾病，以持續(xù)存在的呼吸道癥狀和氣流受限為特征，有害顆?；驓怏w暴露可引起氣道和肺泡異常[1]。慢性氣道炎癥是COPD的主要特點，氣管和肺組織的炎癥細胞浸潤、募集和活化，會上調(diào)炎癥通路蛋白的表達和抑制抗炎介質(zhì)的表達。微小核糖核酸(miRNA,miR)-21的表達與轉(zhuǎn)錄生長因子-β(TGF-β)/無翅和整合位點生長因子5a(Wnt-5a)信號通路關(guān)系密切，在煙霧顆粒刺激COPD氣道重塑中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以增加肺成纖維細胞中miR-21的表達，miR-21水平升高可以增強肺成纖維細胞內(nèi)的TGF-β1/Wnt-5a的促纖維化作用；反之，將miR-21進行基因沉默后就會削弱其促纖維化能力[2]。因此，研究miR-21調(diào)控TGF-β/Wnt-5a信號軸的作用機制對闡明COPD氣道重塑的發(fā)病機制具有重要意義，miR-21有可能成為治療COPD氣道重塑的潛在靶標。源于中醫(yī)理論“培土生金法”的肺康顆粒是廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，具有益氣補肺健脾、止咳化痰平喘之功效。在前期基礎研究中，我們發(fā)現(xiàn)肺康顆粒可能減少大鼠炎癥細胞浸潤，降低肺組織炎癥因子白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-17A(IL-17A)的分泌量，但實驗方案不夠完善，變量控制不夠嚴謹。為進一步探索，2021年3月13日至7月31日，本研究利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)、生物信息學技術(shù)，探索miRNA-21調(diào)控COPD大鼠模型中TGF-β/Wnt-5a信號軸的分子機制，驗證并闡明培土生金法發(fā)揮治療COPD的作用機制，為探索miR-21成為COPD潛在的治療靶點提供理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠90只，SPF級，4月齡，體重(200±20)g，由廣東省實驗動物中心提供，所有大鼠在同一動物房中飼養(yǎng)，溫度(25±1)℃，濕度28%的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。本研究免除相關(guān)倫理審查。

1.2 藥物及試劑 肺康顆粒：由廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由五指毛桃、太子參、茯苓、白術(shù)、苦杏仁、炒紫蘇子等6味中藥組成，每瓶250 g。大鼠TGF-β(泉州市睿信生物科技有限公司，批號：31073)、IL-8(泉州市睿信生物科技有限公司，批號：13147)、IL-17(泉州市睿信生物科技有限公司，批號：10315)、Wnt-5a(泉州市睿信生物科技有限公司，批號：12820)、miRNA-21(天根，批號cyt-716)。

1.3 分組、模型復制及給藥 采用隨機數(shù)字表法將90只SD大鼠分為6組，分別為：空白對照組、模型組及肺康顆粒低、中、高劑量組、地塞米松組，每組15只。

COPD大鼠造模方法：采用煙熏加氣管內(nèi)注入內(nèi)毒素法，將空白對照組外其余各組大鼠放入自制有機玻璃熏箱(80 cm×70 cm×50 cm)內(nèi)被動吸煙，熏煙1次/d，30 min/次，持續(xù)熏煙共20周；第1、14天麻醉大鼠，經(jīng)氣管插管注入內(nèi)毒素脂多糖200 μg/200 μL(注內(nèi)毒素日不熏煙)。

用蒸餾水將肺康顆粒溶解，制成低、中、高劑量肺康顆粒溶液(3.25、6.5、13 g/kg)灌胃使用。空白對照組大鼠，給予正常飼養(yǎng)，不加特殊干預；模型組大鼠，按照上述造模方法，連續(xù)熏煙20周；肺康顆粒低、中、高劑量組及地塞米松組大鼠，在連續(xù)熏煙4周驗證造模成功后，第5周開始，每天熏煙前1 h予藥物處理：肺康顆粒低、中、高劑量組大鼠分別按照等體積0.1、0.2、0.4 mL/10 g體重劑量給予灌胃肺康顆粒溶劑處理，一直持續(xù)給藥16周；地塞米松組大鼠作為陽性對照組，在熏煙處理的第5周開始，每天在熏煙前30 min，按照10 μg/10 g體重的劑量腹腔注射地塞米松針劑，一直持續(xù)16周即實驗結(jié)束。

1.4 取材 末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，20%烏來糖麻醉，麻醉后將大鼠仰臥固定在操作臺上，打開腹腔，腹主動脈取血5 mL，入肝素抗凝管中800 r/min離心5 min，取上清，-20℃冰箱保存，用于酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)測定血清相關(guān)指標。取血后縱行切開頸部皮膚，機械鈍性分離皮下組織暴露氣管，在環(huán)狀軟骨下切一個倒“T”型切口，進行氣管插管。用細棉線在左肺門根部結(jié)扎左側(cè)肺葉。摘取左肺，PBS反復清洗后共回收支氣管肺泡灌洗液(BALF)共5 mL，800 r/min離心5 min后取上清液，剪切成兩部分，一部分浸泡于RNA later保存液中，-80℃冰箱保存，用于qPCR檢測；一部分置于1.5 mL EP管中，-80℃冰箱保存，用于ELISA檢測。

1.5 檢查指標 (1)呼吸功能相關(guān)參數(shù)測定：麻醉后將大鼠仰臥固定在操作臺上，縱行切開頸部皮膚，機械鈍性分離皮下組織暴露氣管，在環(huán)狀軟骨下切一個倒“T”型切口，進行氣管插管。上動物肺功能儀(Flex-ivent，加拿大)檢測呼吸功能相關(guān)參數(shù)，包括：用力肺活量(FVC)、第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)、第0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量的比(FEV0.3/FVC)等。(2)氣道炎癥相關(guān)細胞因子的含量應用ELISA雙抗體夾心法測定大鼠血清、BALF中TGF-β、IL-8、IL-17A的水平。(3)肺組織TGF-β/Wnt-5a mRNA和miR-21的表達水平：采用Real time PCR檢測大鼠肺組織中Wnt-5a、TGF-β、miR-21的表達水平。提取大鼠肺組織RNA，紫外分光光度計測定OD260、OD280以檢測RNA含量，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。制備標準曲線樣品，進行實時熒光定量PCR擴增，檢測Ct值結(jié)果進行標準曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況 空白對照組大鼠無死亡，皮毛呈正常光澤，體質(zhì)量增加，呼吸平穩(wěn)，無明顯咳嗽、氣促、納差、便溏等癥狀。造模過程中，除空白對照組外，其余各組大鼠均有不同程度的毛色萎黃、逐漸出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀(咳、喘、鼻中分泌物由稀薄變黏稠)、體重下降、活動度差。灌胃治療后，肺康顆粒各劑量組、地塞米松組大鼠的毛色光澤度有所改善，咳、喘等呼吸系統(tǒng)癥狀均減輕。模型組死亡1只，肺康顆粒低劑量組死亡1只，地塞米松組死亡2只。

2.2 肺康顆粒對大鼠肺功能的影響 與空白對照組對比，模型組、肺康顆粒各劑量組、地塞米松組的FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC值均顯著降低(P<0.01)；與模型組對比，肺康顆粒各劑量組、地塞米松組的FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC值均顯著升高(P<0.01)，且肺康顆粒各劑量組、地塞米松組組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，肺康顆粒各劑量組升高更加明顯。改善作用與劑量呈現(xiàn)一定的依賴關(guān)系，低劑量肺康顆粒的改善作用較弱，中劑量肺康顆粒的作用次之，高劑量的肺康顆粒改善作用最強。見表1。

表1 各組大鼠肺功能對比

2.3 肺康顆粒對COPD 大鼠血漿及BALF 中TGF-β、IL-8和IL-17A 水平的影響 與空白對照組比較，模型組、肺康顆粒各劑量組、地塞米松組的血漿及BALF 中TGF-β、IL-8和IL-17A水平均顯著升高(P<0.01)；與模型組對比，肺康顆粒各劑量組、地塞米松組的血漿及BALF中TGF-β、IL-8和IL-17A水平均顯著降低(P<0.01)。相對于地塞米松組，肺康顆粒各劑量組炎癥因子水平下降更加明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且其調(diào)節(jié)作用呈一定程度的劑量依賴性。見表2～3。

表2 各組大鼠血漿TGF-β、IL-8和IL-17A水平對比

表3 各組大鼠BALF 中TGF-β、IL-8和IL-17A 水平對比

2.4 肺康顆粒對COPD 大鼠肺組織TGF-β/Wnt-5a mRNA和miRNA-21的表達水平的影響 與空白對照組比較，模型組肺組織中Wnt-5a mRNA、TGF-β、miRNA-21的表達量均明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，肺康顆粒各劑量組、地塞米松組肺組織中Wnt-5a mRNA、TGF-β、miR-21的表達量均明顯下調(diào)(P<0.01)，且肺康顆粒各劑量組的下降更加明顯(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠肺組織中Wnt-5a mRNA、TGF-β、miRNA-21水平對比

3 討論

COPD作為臨床上常見的呼吸系統(tǒng)疾病，目前臨床治療大多以化痰解痙平喘類西藥為主，可以有效緩解患者的癥狀，但效果相對局限，患者肺功能逐年的下降導致生活質(zhì)量低下。中醫(yī)學理論認為COPD穩(wěn)定期本質(zhì)是肺虛及脾、及腎，而肺脾受損最為多見，穩(wěn)定期應積極治本為主，兼顧病理因素。故臨床上采用培土生金治法多能切中病機，獲得佳效[3-7]。本項目課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)肺康顆粒對COPD穩(wěn)定期患者咳嗽、咯痰、喘息、氣短癥狀有明顯的改善作用，同時可使患者CAT評分、mMRC分級顯著降低，并可明顯減少急性加重發(fā)作次數(shù)[8]。動物實驗方面，肺康顆?？梢种艭OPD大鼠肺泡病理結(jié)構(gòu)的破壞，并減少大鼠血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的含量，且肺組織中TNF-α、IL-6 mRNA的表達量均明顯下調(diào)，而Toll樣受體4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)的蛋白表達及胞核蛋白p65表達亦顯著下調(diào)[9]。因此，肺康顆?？赡芡ㄟ^抑制TLR4/NF-κB信號通路進而抑制炎癥反應，從而減輕COPD大鼠的病理結(jié)構(gòu)改變。

Wnt-5a是一種分泌性糖蛋白，為Wnt家族中非經(jīng)典通路的代表，通過活化非經(jīng)典Wnt/Ca2+通路抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin通路[10]。Wnt-5a作為TGF-β的靶基因可刺激肺成纖維細胞誘導膠原和蛋白多糖的沉積、氣道平滑肌增生，使成纖維細胞向肌成纖維細胞的表型改變，這些COPD氣道重塑過程中發(fā)揮重要作用[11-13]。近期一項研究指出，TGF-β/Wnt-5a非經(jīng)典信號通路與COPD發(fā)病機制有關(guān)。香煙煙霧、TGF-β等刺激可使COPD患者肺成纖維細胞中Wnt分泌增加，通過非經(jīng)典途徑抑制肺泡上皮細胞中的Wnt/β-catenin經(jīng)典通路傳導，破壞肺泡上皮細胞修復，誘導成纖維細胞增殖，導致肺修復受損。肺中Wnt-5a過度表達可加劇彈性蛋白酶誘導的肺氣腫擴大，抑制Wnt-5a信號傳導能恢復肺泡功能減緩肺損傷，改善彈性回縮力、順應性和肺功能，這可能是治療COPD的一種新方法[14]。有研究顯示，Wnt-5a能夠促進炎癥細胞因子分泌，抑制體內(nèi)Wnt-5a的表達，下調(diào)TGF-β、TNF-α、IL-1β、IL-8等細胞因子的表達水平，可以阻斷急劇的炎癥反應[15-16]。以上研究表明，肺成纖維細胞中TGF-β/Wnt-5a分泌增加在COPD氣道重塑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是阻斷COPD氣道重塑病理機制的潛在靶標。

miRNA是一類存在于多種生物體中調(diào)控基因表達的內(nèi)源性非編碼RNA，可與3′-UTR結(jié)合降解mRNA或抑制mRNA的翻譯而抑制靶基因的表達，參與調(diào)節(jié)正常生理過程及病理過程，如器官的發(fā)育、創(chuàng)傷的愈合以及腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21是一種非常典型的基因編碼區(qū)域內(nèi)的miRNA，與COPD密切相關(guān)，在COPD氣道重塑的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)miR-21在煙霧顆粒誘導的COPD小鼠組織中呈高表達，miR-21反義探針可以顯著減輕COPD小鼠的肺組織病理改變，提示miR-21可能成為治療COPD氣道重塑的潛在靶點。

TGF-β/Wnt-5a信號通路與miR-21的表達互相影響，miR-21水平升高可以增加肺內(nèi)TGF-β1/Wnt-5a的促纖維化作用，而TGF-β1也可以促進miR-21的表達[2]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，COPD大鼠血漿及BALF中TGF-β、IL-8、IL-17A等炎癥細胞因子的含量，肺組織中Wnt-5a mRNA、TGF-β、miRNA-21的表達量比正常組高，而經(jīng)過肺康顆粒灌胃干預后，COPD大鼠的血漿及BALF炎癥因子含量、肺組織Wnt-5a mRNA、TGF-β、miRNA-21的表達量均明顯下降，表明肺康顆粒治療COPD大鼠的機制可能與降低TGF-β、IL-8、IL-17A等炎癥因子相關(guān)，可以下調(diào)肺臟組織TGF-β及Wnt-5a mRNA的表達，抑制miRNA-21的表達水平。

綜上所述，本課題組經(jīng)過多年臨床觀察認為COPD穩(wěn)定期的基本病機是肺脾兩虛，因此肺康顆粒以此為指導原則，以健脾益肺為治法，臨床可以有效緩解患者呼吸道癥狀，延緩肺功能下降改善患者肺功能，調(diào)節(jié)炎癥因子，改善膈肌疲勞等作用。本研究表明肺康顆?？赡芡ㄟ^TGF-β/Wnt-5a信號通路干預miR-21基因的表達，降低血清及肺泡灌洗液TGF-β、IL-8、IL-17A等炎癥因子，改善大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC肺功能指標，進而減輕COPD大鼠氣道慢性炎癥反應，但其相關(guān)的生物學效應機制仍有待進一步的研究。

利益相關(guān)聲明：論文內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。

作者貢獻說明：實驗設計為張高和楊柳柳，實驗實施為張高，黃楚栓、褚慶民進行實驗評估，張高執(zhí)筆，楊柳柳審校。