蔣姣姣, 丁芝祥, 邱梅園, 黃嵐珍

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科(廣西桂林 541001)；2桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心(廣西桂林 541001)

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreo-retinopathy，PVR)是以視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等在視網(wǎng)膜表面、視網(wǎng)膜下和玻璃體腔內(nèi)發(fā)生遷移增殖，增殖膜發(fā)展、收縮產(chǎn)生視網(wǎng)膜固定皺褶造成牽拉性視網(wǎng)膜脫離為特征的一種嚴重眼病[1-2]。RPE細胞既是PVR病變中主要的移行、分裂、增殖細胞，也是PVR膜中主要的細胞成分[3]。目前，手術(shù)仍是治療PVR的標準方法，但手術(shù)只能清除病變的增生組織，并不能預(yù)防和阻止細胞的增生和遷移，因而PVR復(fù)發(fā)率較高，故目前傾向于手術(shù)聯(lián)合眼內(nèi)用藥[4]。現(xiàn)階段研究用于PVR防治的藥物主要是有抗炎藥、抗腫瘤藥、抗生長因子藥物等[5]?？鼓[瘤藥物特殊的抑制細胞生長增殖、抗代謝、促進細胞凋亡等功能使其早用于眼科疾病，如絲裂霉素、5-氟尿嘧啶可明顯抑制青光眼濾過手術(shù)[6-7]后瘢痕形成，可有效減少翼狀胬肉手術(shù)[8]的復(fù)發(fā)；新型抗腫瘤類藥物如貝伐單抗、阿柏西普等在眼部新生血管類疾病如角膜新生血管、新生血管性青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性、息肉狀脈絡(luò)膜血管病變等疾病中[9-10]得到了很好的應(yīng)用。而多西他賽(DTX)作為一種以微管為靶點的高效低毒的新型抗腫瘤藥物，具有較高的抗腫瘤活性、抗腫瘤血管形成和誘導(dǎo)凋亡作用[11]。目前廣泛應(yīng)用于臨床多種腫瘤的治療，而在眼科領(lǐng)域應(yīng)用較少，2019年12月至2020年7月我們通過體外培養(yǎng)的細胞作為實驗對象，利用DTX特有的促進細胞凋亡的機制，研究其對RPE細胞的增殖抑制作用及其機制，為研究和治療PVR提供一定的臨床理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和主要試劑 DTX注射液(江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司，劑量為0.5 mL：20 mg/支)；人RPE-19細胞株(桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心)；DMEM培養(yǎng)基、2.5 g/L胰蛋白酶、胎牛血清(美國Gibco公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶和碘化丙啶(PI)(美國Sigma公司)。

1.1.2 主要儀器 Thermo細胞培養(yǎng)箱(美國Electron Corporation)，細胞培養(yǎng)瓶、倒置相差顯微鏡(日本Olympus/Leica公司)、FACSAriaⅢ流式細胞儀(美國BD公司)，酶標儀(瑞士帝肯公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥物配制 hRPE細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d用胰蛋白酶消化傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制 取對數(shù)生長期的細胞胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，調(diào)整濃度為2×104·L-1，將細胞接種于96孔板中。設(shè)空白對照組、陰性對照組和DTX組(分別為10、20、40、80 μg/mL)，空白對照組加入200 μL不含細胞培養(yǎng)液，陰性對照組和DTX組分別加入100 μL細胞懸液，每組設(shè)5個復(fù)孔，標準條件下培養(yǎng)細胞至貼壁后，去上清液后陰性對照組加入200 μL DMEM培養(yǎng)基，DTX組分別加入不同濃度(10、20、40、80 μg/mL)DTX 200 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。藥物作用結(jié)束后吸出上清液，每孔加入90 μL 培養(yǎng)液和10 μL MTT，培養(yǎng)4 h后，離心去上清液，加入DMSO 100 μL/孔，振蕩至結(jié)晶完全溶解，在酶標儀490 nm波長處測定各孔吸光度A值，計算細胞增殖抑制率，實驗重復(fù)3次取平均值。細胞增殖抑制率=(陰性對照組A值-DTX組A值)/(陰性對照組A值-空白對組組A值)×100%。

1.2.3 凋亡細胞的觀察 取對數(shù)生長期的細胞制成細胞懸液，按每孔1×105個接種于6孔板上，標準條件下培養(yǎng)細胞，設(shè)置不同濃度DTX組和空白對照組，待細胞融合至60%后分別加入不同濃度(20、40、80 μg/mL)DTX和相同體積DMEM為空白細胞對照組，繼續(xù)培養(yǎng)作用48 h后，吸除6孔板上清，PBS洗滌2次，每孔加入37%甲醇，20 min固定，吸除后PBS洗滌1次，再加入DAPI染色5 min，抗淬滅熒光封片液固定蓋玻片移入Olympus熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 取對數(shù)生長期的細胞以10×106·L-1濃度接種于直徑為10 cm培養(yǎng)皿中，因MTT法中10 μg/mL DTX對hRPE細胞抑制率較小，細胞貼壁后DTX組加入DTX(20、40、80 μg/mL)200 μL，陰性對照組加入200 μL DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。24、48 h后分別用胰蛋白酶消化離心后收集細胞，PBS緩沖液洗滌后70%冷乙醇固定過夜。次日去除冷乙醇，PBS緩沖液洗滌后加入0.1 mg/mL RNA酶37℃水浴30 min，加入25 μg/mL PI染色30 min后置于流式細胞儀進行檢查分析細胞周期分布，數(shù)據(jù)采用流式細胞儀自帶軟件分析G1/G0期、S期和G2/M期細胞比例。

2 結(jié)果

2.1 DTX對hRPE細胞增殖的抑制 MTT結(jié)果顯示，隨著DTX濃度的增加，DTX對hRPE細胞的增殖抑制作用明顯增強(P<0.05)，相同時間點20 μg/mL與10 μg/mL DTX間、40 μg/mL與20 μg/mL DTX間、80 μg/mL與40 μg/mL DTX間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而隨著DTX作用于hRPE細胞時間的延長，對其抑制作用稍增強，40 μg/mL、80 μg/mL DTX作用hRPE 72 h與48 h比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余濃度不同時間點兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)DTX濃度為80 μg/mL作用于hRPE細胞48 h時，細胞增殖抑制達93%，隨著藥物濃度的增加，DTX能明顯抑制hRPE細胞的增殖，其抑制作用呈濃度依賴性。見表1。

表1 各組不同時間hRPE細胞增殖抑制率

2.2 hRPE凋亡細胞形態(tài)學(xué)觀察 取不同濃度DTX作用于hRPE細胞48 h，染色后置于熒光顯微鏡下觀察，細胞中細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)致密濃染的顆粒狀或條索狀熒光的凋亡細胞，隨著濃度的增加，細胞數(shù)明顯減少，凋亡細胞數(shù)增加，見圖1。

注：A:20 μg/mL; B:40 μg/mL; C:80 μg/mL;白色箭頭示：凋亡細胞

2.3 DTX對hRPE細胞周期的影響 流式細胞儀檢測顯示，加入DTX的hRPE細胞各周期比例發(fā)生改變，培養(yǎng)24、48 h的hRPE細胞中G0/G1期、S期細胞比例減少，G2/M期細胞增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=223.04，P<0.01；F=724.93,P<0.01)；隨著濃度增加，G2/M期細胞增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)；當(dāng)DTX濃度為80 μg/mL作用hRPE 48 h時細胞明顯阻滯于G2/M期，見表2～3、圖2。

注：A:正常細胞周期曲線; B: 20 μg/mL DTX作用48 h細胞周期曲線; C:40 μg/mL DTX作用48 h細胞周期曲線; D:80 μg/mL DTX作用48 h細胞周期曲線

表2 DTX作用24 h與對照組各期細胞構(gòu)成比較

表3 DTX作用48 h與對照組各期細胞構(gòu)成比較

3 討論

DTX的前體是從歐洲漿果紫杉的針葉中提取，經(jīng)半合成而獲得的紫杉醇衍生物，屬于細胞周期特異性藥, 可通過促進微管雙聚體裝配成微管，同時防止去多聚化過程而使微管穩(wěn)定，從而抑制細胞有絲分裂和增殖[12]。近年來許多研究證明,DTX可誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡，正是由于這種誘導(dǎo)多種細胞凋亡的能力, 使DTX具有特殊的臨床療效。在眼科領(lǐng)域，有學(xué)者[13-14]利用DTX抑制晶狀體上皮細胞增殖的作用，在白內(nèi)障摘除術(shù)后晶狀體囊袋空腔內(nèi)植入DTX聚合物緩釋劑，可很好防治后發(fā)性白內(nèi)障發(fā)生，該制劑可持續(xù)釋藥1個月以上。黃金榮等[15]用DTX滴眼液滴用堿燒傷的兔眼，可有效抑制角膜新生血管的增殖，并可減少角膜組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達，對眼部新生血管性疾病提供了實驗基礎(chǔ)。而DTX在眼底PVR的研究方面尚未開展。PVR是眼內(nèi)RPE細胞、Müller細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等增殖、遷移的病理改變過程，RPE細胞被認為在PVR過程中發(fā)揮核心作用[4]，所以我們利用hRPE細胞為材料，研究DTX對hRPE細胞增殖的抑制和對細胞周期的影響，為PVR治療提供新的用藥途徑。

本研究通過不同濃度的DTX作用于體外培養(yǎng)的hRPE細胞，結(jié)果表明當(dāng)DTX濃度大于20 μg/mL時，可抑制hRPE細胞的生長，呈濃度依賴性；20 μg/mL DTX作用hRPE 48 h后觀察可見凋亡細胞，并隨著濃度增加細胞數(shù)明顯減少、凋亡細胞增多。流式細胞術(shù)顯示，加入DTX的hRPE細胞G0/G1期、S期細胞比例減少、G2/M期細胞增加，說明DTX將hRPE細胞阻滯于G2/M期，即該藥可調(diào)控細胞有絲分裂誘導(dǎo)轉(zhuǎn)折點。隨著藥物濃度逐漸增加，G2/M期細胞增加不明顯，可能與隨著濃度增加DTX抑制hRPE細胞增殖同時誘導(dǎo)其凋亡且存在細胞毒性相關(guān)。有研究[16]表明，DTX在作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞，低劑量時抑制細胞遷移、較高劑量時抑制細胞增殖、高劑量時出現(xiàn)細胞毒性促進細胞凋亡，DTX是否亦存在低劑量抑制hRPE細胞遷移有待進一步實驗論證，這對DTX在眼內(nèi)通過抑制RPE細胞的遷移而防治PVR發(fā)生有重要意義，同時這對于我們探討最合適濃度DTX抑制RPE細胞增殖、遷移同時具有最小細胞毒性提供實驗依據(jù)。

抗腫瘤藥物的毒性作用抑制了其在體內(nèi)的應(yīng)用，為了增加和延長療效、減少眼內(nèi)毒性，用于眼部的抗腫瘤藥物被制成各種緩釋試劑，一部分藥物已廣泛應(yīng)用于臨床，一部分也已經(jīng)進入臨床試驗階段，但仍需要更深入的基礎(chǔ)研究和臨床實踐，也需要多學(xué)科包括藥物、化學(xué)、材料、眼科的交叉合作，開發(fā)出新的安全有效的眼內(nèi)給藥體系。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明無利益沖突。

作者貢獻說明：蔣姣姣直接參與醞釀和設(shè)計實驗，采集數(shù)據(jù)，分析解釋數(shù)據(jù)，起草論文，獲取研究經(jīng)費；丁芝祥直接參與醞釀和設(shè)計實驗并指導(dǎo)；邱梅園直接參與醞釀和設(shè)計實驗并指導(dǎo)；黃嵐珍直接參與醞釀和設(shè)計實驗，采集數(shù)據(jù)，分析解釋數(shù)據(jù)并指導(dǎo)。