劉雪輝, 吳麗美, 劉達彬, 李志海, 劉華森, 伍紹國△, 胡炎偉

1廣州市第十二人民醫(yī)院檢驗科(廣東廣州 510620); 2廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗部(廣東廣州 510623)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種影響大、中型動脈的慢性炎癥性疾病，是冠心病、心肌梗死、外周血管病等心血管疾病的主要病因，病死率逐年上升且發(fā)病人群趨于年輕化。AS發(fā)病機制非常復(fù)雜，伴隨著內(nèi)皮細胞損傷、炎癥反應(yīng)、脂肪斑塊形成、平滑肌細胞增殖和單核細胞遷移。內(nèi)皮細胞功能障礙是心血管疾病的發(fā)病機制，一些來自AS病變內(nèi)活化細胞的促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能障礙。研究表明炎癥在AS的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[1-2]。許多因素可以刺激血管內(nèi)皮細胞的損傷。例如，死亡的內(nèi)皮細胞可以釋放促炎細胞因子，從而放大炎癥反應(yīng)。反過來，炎癥因子的釋放會導(dǎo)致細胞的堆積和壞死，堆積的細胞逐漸形成具有壞死核心的AS斑塊。有研究表明通過抑制IL-6、TNF-α、核因子-κB(NF-κB)等促炎因子可對AS有積極的影響[3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又稱內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌細胞壁的外膜成分。外源性脂多糖被吸收到血液中會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷和炎癥細胞分泌細胞因子，引起炎癥反應(yīng)，這是炎癥的重要病理因素[4]。然而，目前LPS誘導(dǎo)炎癥的分子機制尚不清楚。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的缺乏蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。它雖然不能編碼蛋白質(zhì)，但它能通過染色體修飾、干擾mRNA的剪切、影響miRNA的功能、與mRNA結(jié)合并影響其翻譯等方式在許多疾病[5-6]，特別是AS中起著關(guān)鍵作用[7-9]。lncRNA-NEXN AS1通過調(diào)節(jié)肌動蛋白結(jié)合蛋白(NEXN)減緩AS的發(fā)展[10]。有文獻報道lncRNA CDKN2B-AS1通過抑制ADAM10表達降低AS中的炎癥反應(yīng)并促進膽固醇外流[11]。lncRNA-FA2H-2抑制MLKL的表達，減輕炎癥反應(yīng)，對AS起保護作用[12]。上述報道表明lncRNA與炎癥、AS之間存在緊密聯(lián)系。盡管已有很多l(xiāng)ncRNA被發(fā)現(xiàn)，但在了解lncRNA在AS中的具體作用機制方面仍不夠深入和詳細。我們發(fā)現(xiàn)LncRNA RP11-490M8.1在AS斑塊中的表達顯著下調(diào)。它是位于染色體2p22.3上的一個366 kb的長鏈非編碼RNA。目前鮮見LncRNA RP11-490M8.1關(guān)于AS的報道。為此，我們于2019年1月至2020年6月就LncRNA RP11-490M8.1在AS中的相關(guān)作用進行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 人臍靜脈內(nèi)皮細胞系購自美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection，ATCC庫)。本研究經(jīng)廣州市第十二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批同意[第(2022026)號]。

1.2 主要試劑和耗材 實時熒光定量PCR試劑盒購自上海立菲生物技術(shù)公司，含有綠色熒光蛋白的空LV載體(LV mock)和含有GFP熒光的過表達LncRNA RP11-490M8.1的慢病毒載體(LV-LncRNA RP11-490M8.1)購自上海和元生物科技有限公司，高糖培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，DMEM)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自上海 Gibco公司，多克隆兔抗IL-6(YT5348)和TNF-α(YT4689)均購自美國ImmunoWay生物技術(shù)公司，多克隆兔抗 核因子-κB(NF-κB，AF5006-50)購自加拿大Affinity生物制品公司,內(nèi)參tubulin抗體及兔二抗購自美國 Santa公司，0.25% EDTA-胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)均購自廣州一駿生物制品有限公司，細胞培養(yǎng)皿、凍存管、離心管、6孔板均購自美國康寧(corning)公司,引物合成及測序均由上海生工生物工程有限公司完成，本研究所用引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.3 內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)和加藥干預(yù) 在DMEM中添加10%FBS和雙抗(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察細胞生長匯合度達到80%～90% 時傳代。傳代后培養(yǎng)4～6 h，觀察細胞貼壁良好，換液，根據(jù)實驗設(shè)計加入LPS干預(yù)或轉(zhuǎn)染慢病毒載體。濃度梯度干預(yù)處理方法：加入不同濃度LPS(0、250、500、1 000 ng/mL)到內(nèi)皮細胞，培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗。時間梯度干預(yù)處理方法：加入1 000 ng/mL LPS到內(nèi)皮細胞，分別培養(yǎng)0、12、24、48 h，在特定時間點收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 慢病毒載體與細胞轉(zhuǎn)染 構(gòu)建含有綠色熒光蛋白GFP的空載體(LV-mock)和含有GFP的慢病毒介導(dǎo)的lncRNA RP11-490M8.1過表達載體(LV-RP11-490M8.1)。臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)以2×106個細胞/孔的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，分為4組進行干預(yù)：(1)慢病毒空載體對照組(對照組，LV-MOCK)：慢病毒空載體(LV-MOCK)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞培養(yǎng)24 h；(2)慢病毒空載體加LPS(LV-MOCK +LPS): LV-MOCK轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞培養(yǎng)6 h，加1 000 ng/mL的LPS培養(yǎng)18 h；(3)慢病毒過表達組(LV-RP11-490M8.1)：LV-LncRNA RP11-490M8.1轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞培養(yǎng)24 h；(4)LncRNA RP11-490M8.1過表達加LPS(LV-RP11-490M8.1+LPS)：LV-LncRNA RP11-490M8.1轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞培養(yǎng)6 h，加1 000 ng/mL的LPS培養(yǎng)18 h。HUVECs在添加10%FBS、抗生素(100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)和2 μg/mL嘌呤霉素的DMEM中培養(yǎng)2周以獲得穩(wěn)定表達株。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測LncRNA RP11-490M8.1的表達水平和轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功后進行后續(xù)實驗。

1.5 免疫印跡(western blot)試驗檢測蛋白表達水平 收集各組細胞，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的放射免疫沉淀緩沖液中裂解，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，取50 μg總蛋白和上樣緩沖液混合，煮沸15 min使其變性。用SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃下用一抗于搖籃孵育過夜,用TBST 緩沖液洗膜3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記兔二抗(稀釋度1∶5 000)孵育2 h，用TBST 緩沖液洗膜3次，用ECL發(fā)光液顯色，并用ImageJ軟件進行條帶分析，計算IL-6、TNF-α、NF-κB的蛋白相對表達量。

1.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測mRNA表達水平 收集各組細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，檢測其濃度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增，以mRNA擴增以GAPDH、LncRNA擴增以U6為內(nèi)參，用2-ΔCt法計算lncRNA RP11-490M8.1、IL-6、TNF-α、NF-κB的RNA相對含量。每次試驗均重復(fù)檢測3次。

2 結(jié)果

2.1 LPS對內(nèi)皮細胞炎癥因子IL-6、TNF-α、NF-κB的mRNA和蛋白水平的影響 我們檢測濃度梯度LPS對內(nèi)皮細胞的影響，qRT-PCR和western blot結(jié)果顯示LPS能顯著上調(diào)IL-6、TNF-α、NF-κB的mRNA和蛋白質(zhì)表達。IL-6和NF-κB在1 000 ng/mL濃度上調(diào)最明顯(P<0.05)，而TNF-α在500 ng/mL干預(yù)濃度上調(diào)最明顯(P<0.01)，其對LPS的敏感度較IL-6和NF-κB明顯。其次，我們檢測LPS時間梯度對內(nèi)皮細胞的影響，qRT-PCR和western blot結(jié)果顯示LPS能顯著上調(diào)IL-6、TNF-α、NF-κB的表達(P<0.05)。見表2～3，圖1。

表2 各組細胞的IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA相對表達結(jié)果

表3 各組細胞的IL-6、TNF-α、NF-κB 蛋白質(zhì)相對表達結(jié)果

注：內(nèi)參tubulin為微管蛋白；A：0、250、500、1 000 ng/mL的LPS作用于內(nèi)皮細胞48 h；B：1 000 ng/mL的LPS分別作用于內(nèi)皮細胞0、12、24、48 h

2.2 LPS對LncRNA RP11-490M8.1表達的影響 基因芯片分析結(jié)果顯示LncRNA RP11-490M8.1在AS斑塊中顯著下調(diào)(P<0.000 1)，本研究結(jié)果顯示LncRNA RP11-490M8.1的表達水平能被LPS抑制，在1 000 ng/mL濃度下調(diào)最明顯(P<0.01)。另外，研究結(jié)果顯示LncRNA RP11-490M8.1的表達水平能時間依賴地被LPS抑制，在48 h處下調(diào)最明顯(P<0.01)，見表4。于是選取1 000 ng/mL和48 h作為后續(xù)研究的濃度和時間。

表4 各組細胞的LncRNA RP11-490M8.1表達水平檢測結(jié)果

2.3 慢病毒過表達LncRNA RP11-490M8.1對炎癥因子IL-6、TNF-α、NF-κB的mRNA和蛋白水平的影響 研究結(jié)果表明，與LV-MOCK對照組相比，過表達組的LncRNA RP11-490M8.1上調(diào)113倍(112.96±3.35vs.1，P<0.001)，說明轉(zhuǎn)染成功，獲得穩(wěn)定表達株可用于后續(xù)實驗。qRT-PCR和western blot結(jié)果顯示IL-6、TNF-α、NF-κB的mRNA和蛋白水平隨著LncRNA RP11-490M8.1的過表達而明顯下調(diào)(P<0.05)。見表5、圖2。

表5 內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染慢病毒后IL-6、TNF-α、NF-κB的表達水平

圖2 內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染慢病毒后IL-6、TNF-α、NF-κB的蛋白表達水平

2.4 過表達LncRNA RP11-490M8.1對LPS所致炎癥因子的影響 與對照組相比，加LPS組的炎癥因子的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平明顯下調(diào)(P<0.05),加過表達組的炎癥因子表達下調(diào)，這與前面研究結(jié)果相符(P<0.05)，LPS誘導(dǎo)的炎癥因子上調(diào)程度能被過表達LncRNA RP11-490M8.1抑制，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，回到正常水平。見表6、圖3。

表6 分組干預(yù)后IL-6、TNF-α、NF-κB的mRNA和蛋白表達水平

注：A:LV-MOCK; B:LV-RP11-490M8.1; C:LV-MOCK +LPS; D:LV-RP11-490M8.1+LPS

3 討論

AS是一種動脈壁脂質(zhì)滯留引起的慢性炎癥性疾病，血管內(nèi)皮細胞在AS的早期炎癥反應(yīng)中起重要作用。NF-κB是一種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，是炎癥反應(yīng)的介質(zhì)[13]。當(dāng)NF-κB在炎癥反應(yīng)中被激活時，它從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，然后充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致炎癥相關(guān)基因(TNF-α、IL-6)表達增加[14]。IL-6是一種多效性細胞因子，與先天免疫和適應(yīng)性免疫有關(guān)，調(diào)節(jié)急性期反應(yīng)和慢性炎癥。在斑塊破裂的情況下，IL-6水平升高，高水平的促炎細胞因子IL-6一直被認為是AS疾病發(fā)展和并發(fā)癥的危險因素[15]。在炎癥早期，TNF-α被認為是一個能促進炎癥負反饋的關(guān)鍵細胞因子[16]。TNF-α促進各種炎癥細胞的分化和增殖[17]，改變內(nèi)皮細胞功能，導(dǎo)致血管功能障礙，在AS的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。簡言之，NF-κB的激活、TNF-α和IL-6的分泌促進AS炎癥反應(yīng)，多項研究表明抑制NF-κB、TNF-α和IL-6表達有助于減緩AS的發(fā)展[18-19]。有研究報道LPS刺激單核細胞增加NF-κB基因的表達，并促進人外周血中TNF-α和IL-6的分泌[20]。另外，LPS也可上調(diào)動脈血管內(nèi)皮細胞的IL-6、TNF-α和NF-κB的表達[21]。我們研究的是臍靜脈內(nèi)皮細胞，結(jié)果顯示LPS能明顯上調(diào)IL-6、TNF-α和NF-κB的表達，與最新文獻報道的結(jié)果相符[22]。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)在各種疾病的作用機制成為近年來的研究熱點，它是一類長度超過200個核苷酸的不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，存在于細胞核和細胞質(zhì)中。LncRNA可與蛋白質(zhì)、DNA和RNA結(jié)合，調(diào)節(jié)疾病的發(fā)生發(fā)展和動脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性[23]。LncRNA SNHG16通過NF-κB信號通路促進巨噬細胞增殖和炎癥反應(yīng)，從而加速AS發(fā)展[24]。其次，過表達LncRNA MALAT1能促進炎癥細胞因子IL-6和TNF-α的分泌，從而增強內(nèi)皮細胞的炎癥活性[25]。另外，還有文獻報道敲除LncRNA OIP5-AS1基因能通過阻斷AKT/NF-κB信號通路抑制HUVECs細胞炎癥反應(yīng)[26]。上述研究結(jié)果表明LncRNA與炎癥因子IL-6、TNF-α和NF-κB存在密切聯(lián)系。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)LPS下調(diào)LncRNA RP11-490M8.1的表達，推測LncRNA RP11-490M8.1很可能是LPS誘導(dǎo)炎癥的靶標分子。而過表達LncRNA RP11-490M8.1能抑制IL-6、TNF-α和NF-κB的表達，表明LncRNA RP11-490M8.1對炎癥因子起負向調(diào)控作用。另外，我們還發(fā)現(xiàn)過表達LncRNA RP11-490M8.1能減弱LPS誘導(dǎo)炎癥因子IL-6、TNF-α和NF-κB的上調(diào)程度，上述結(jié)果提示LncRNA RP11-490M8.1介導(dǎo)LPS抑制炎癥反應(yīng)，在AS中發(fā)揮積極的保護作用。

本課題組通過3對AS斑塊組織和正常動脈內(nèi)膜組織進行基因芯片分析發(fā)現(xiàn)LncRNA RP11-490M8.1在AS斑塊中的表達水平較正常組織顯著下調(diào)。因此，我們對LncRNA RP11-490M8.1產(chǎn)生極大興趣。本文的創(chuàng)新之處是首次探討在AS疾病中LncRNA RP11-490M8.1與炎癥之間的關(guān)系。本研究的結(jié)果顯示，已被普遍認為具有致炎作用的LPS能明顯抑制LncRNA RP11-490M8.1表達、促進炎癥因子(IL-6，TNF-α，NF-κB)的表達，基因芯片分析結(jié)果顯示LncRNA RP11-490M8.1在AS內(nèi)膜組織中的表達顯著被抑制。根據(jù)我們的研究結(jié)果，可推斷LncRNA RP11-490M8.1很可能是LPS在AS中發(fā)揮促炎作用的靶向分子，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。其具體機制有待更深入的研究，且需動物實驗加以驗證我們的推測。

利益相關(guān)聲明：本文所有作者共同認可文章，無利益沖突。

作者貢獻說明：研究設(shè)計為胡炎偉，伍紹國，研究方案執(zhí)行為劉雪輝，數(shù)據(jù)整理為劉達彬，統(tǒng)計分析為劉華森，文章撰寫為李志海，論文評閱為吳麗美。