宮滿(mǎn)成, 倪文君, 董文靜, 袁潤(rùn)強(qiáng)

中山市人民醫(yī)院 1泌尿外科, 3化療科(廣東中山 528403)；2珠海市人民醫(yī)院泌尿外科(廣東珠海 519000)

前列腺癌是泌尿外科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在男性罹患腫瘤中，其發(fā)病率排名第二，也是非皮膚性腫瘤中最常見(jiàn)的一種。在不同地區(qū)和不同種族之間前列腺癌發(fā)病率存在差異，據(jù)統(tǒng)計(jì)大洋洲地區(qū)發(fā)病率高于亞洲及北非地區(qū)[1-3]。癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，其居男性惡性腫瘤發(fā)病率首位，病死率居第2位[2]。近年來(lái)我國(guó)的前列腺癌發(fā)病率也明顯升高。雖然前列腺癌根治手術(shù)越來(lái)越完善，對(duì)于轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者，也可以采取內(nèi)分泌等多種治療方法，但是每年仍然有很多人會(huì)死于該種疾病[4]。因此尋找更好的治療方法顯得尤為重要。近幾十年來(lái)，光療包括光動(dòng)力療法(PDT)和光熱療法(PTT)[5-7]，作為一種非常有前景的癌癥治療技術(shù)而受到廣泛關(guān)注。光療的作用原理是光催化而產(chǎn)生的活性氧(ROS)可以與癌細(xì)胞的細(xì)胞膜及其內(nèi)部結(jié)合并相互反應(yīng)，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞的死亡[8-9]，達(dá)到治療癌癥的作用。有研究學(xué)者報(bào)道，作為一種無(wú)機(jī)光敏劑，二氧化鈦(TiO2)一直被用于紫外線光動(dòng)力治療癌癥[10-11]。然而，在TiO2介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)治療腫瘤的過(guò)程中，由于紫外光溫度過(guò)高[12]、穿透深度過(guò)淺以及毒性[13]等原因，阻礙了其在臨床的進(jìn)一步研究及應(yīng)用。為了解決以上問(wèn)題，我們合成了一種可以被近紅外光激發(fā)的黑色TiO2納米材料。與紫外光相比，利用近紅外光作為激發(fā)光解決了溫度過(guò)高、穿透深度過(guò)淺以及毒性等問(wèn)題，具有非常好的腫瘤治療前景。我們于2020年3月至2021年10月進(jìn)行了該實(shí)驗(yàn)研究(項(xiàng)目已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查)。我們采用簡(jiǎn)單的煅燒法和原位可控固相反應(yīng)相結(jié)合的方法成功合成了黑色TiO2納米材料。其具有吸收可見(jiàn)光和近紅外光的能力，作為一種新型的光敏劑具有良好的腫瘤治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 TiO2粉(包含71%銳鈦礦和29%金紅石)購(gòu)自德國(guó)德固賽有限公司，氫化硼鈉(NaBH4，98%)購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司，乙二胺、無(wú)水乙醇購(gòu)自天津科美爾中國(guó)化學(xué)試劑有限公司，CCK-8購(gòu)自于日本Dojindo Corp 公司。ELX800 全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Tek公司，F(xiàn)V1000 激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本 Olympus 公司。

1.2 合成方法 將1.0 g TiO2粉(記作TP)分散于50 mL去離子水中，磁攪拌30 min。在繼續(xù)攪拌的同時(shí)，緩慢滴加7 mL乙二胺至pH值達(dá)到11，將混合物轉(zhuǎn)移到有3個(gè)頸連接冷凝器管的100 mL燒瓶中，并在95 ℃下維持48 h。自然冷卻至室溫后，收集得到的溶液，用去離子水沖洗多次，在60 ℃下干燥24 h。然后將獲得的粉末在700 ℃煅燒2 h(記為T(mén)P-700)。取0.5 g制備的樣品與0.5 g NaBH4在室溫下充分混合30 min。然后將混合物轉(zhuǎn)移至瓷船中，置于管狀爐中，在350 ℃氬氣中退火1 h。自然冷卻至室溫，得到黑色TiO2NPs(記為b-TP-700)，用去離子水洗滌3次，除去未反應(yīng)的NaBH4。為了比較，在同樣的條件下加入NaBH4合成了未煅燒的TP(記為b-TP)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和密度，確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80%左右，用 0.25%的胰蛋白酶消化，按合適比例進(jìn)行細(xì)胞傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 b-TP-700的毒性檢測(cè) 將前列腺癌LNCaP細(xì)胞以4×103接種于96孔板，用一系列b-TP-700濃度(0、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00 μg/mL)處理細(xì)胞12、24、48 h。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)評(píng)估細(xì)胞活力。所有實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將上述處理好的細(xì)胞，每孔加入20 μL的CCK-8，輕輕搖晃后，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 利用熒光共聚焦顯微鏡觀察b-TP-700對(duì)前列腺癌細(xì)胞的毒性 LNCaP細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，在37℃，含5% CO2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。將達(dá)到80%～90%融合的細(xì)胞與1 000.00 μg/mL的b-TP-700共培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗多次。隨后用calcein-AM和PI溶液共染細(xì)胞15 min。

1.6 CCK-8檢測(cè)b-TP-700介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用 為了檢測(cè)b-TP-700介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)療法對(duì)LNCaP細(xì)胞的治療效果，將LNCaP細(xì)胞以4×103接種于96孔板中并培養(yǎng)24 h，然后更換為含有的不同濃度的b-TP-700(31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 μg/mL)的培養(yǎng)液孵育。96孔板分別暴露于激光照射(1 W/cm,808 nm)0～7 min(即0、1、3、5、7 min)。利用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的活力。

1.7 檢測(cè)b-TP-700介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)過(guò)程中ROS的產(chǎn)生量 LNCaP細(xì)胞在含有250 μg/mL的b-TP-700的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，利用激光(1 W/cm,808 nm)照射細(xì)胞5 min，用2,7-二氯-二氫熒光雙乙酸(DCFH-DA)溶液替代細(xì)胞培養(yǎng)液，再孵育30 min。未進(jìn)行激光照射的細(xì)胞作為對(duì)照組。隨后，我們利用熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)綠色熒光，因?yàn)榛钚匝?ROS)可以促使DCFH-DA轉(zhuǎn)化為高熒光的2,7-二氯熒光素(DCF)。

1.8 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 12只BALB/c-nu雌性裸鼠，5～6周齡，體重19～23 g；通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表將12只裸鼠分為3組：(1)LNCaP細(xì)胞組。(2)250 μg/mL的b-TP-700處理組：LNCaP細(xì)胞在含有250 μg/mL的b-TP-700的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 min。(3)250 μg/mL的b-TP-700+激光(1 W/cm,808 nm)照射組：LNCaP細(xì)胞在含有250 μg/mL的b-TP-700的培養(yǎng)液中培養(yǎng)并利用激光(1 W/cm,808 nm)照射細(xì)胞5 min。用帶6號(hào)針頭的注射器抽取0.2 mL含2×107個(gè)活細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于每只裸鼠的右后背部。接種3周后，麻醉無(wú)痛處死裸鼠，切取移植瘤。

2 結(jié)果

2.1 b-TP-700的毒性檢測(cè) 不同濃度的b-TP-700處理LNCaP細(xì)胞，細(xì)胞的活力沒(méi)有明顯的降低，并且各組之間的細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。同時(shí)我們從熒光顯微鏡的結(jié)果可以看出，500.00 μg/mL的 b-TP-700作用LNCaP細(xì)胞24 h后，細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變，也未見(jiàn)明顯的死細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

表1 不同濃度的b-TP-700處理LNCaP細(xì)胞12、24、48 h后各組的細(xì)胞活力情況

注：A：鈣黃綠素染色細(xì)胞后利用熒光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞，細(xì)胞未出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變；B：PI染色細(xì)胞后利用熒光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞，未見(jiàn)明顯的死細(xì)胞

2.2 b-TP-700介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)療法對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用 在激光激發(fā)時(shí)間相同的情況下，隨著b-TP-700濃度的增加，LNCaP細(xì)胞的活力明顯下降。在相同濃度的b-TP-700作用于LNCaP細(xì)胞時(shí)，隨著激光激發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，LNCaP細(xì)胞的活力明顯下降(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 不同濃度的b-TP-700及不同的激光激發(fā)時(shí)間對(duì)LNCaP細(xì)胞活力的影響

2.3 檢測(cè)b-TP-700介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)療法中ROS的產(chǎn)生量 在激光的激發(fā)下，b-TP-700組可以檢測(cè)到由DCF產(chǎn)生的明顯的綠色熒光(圖2-A)，相反,在對(duì)照組中卻幾乎觀察不到明顯的綠色熒光(圖2-B)。

注：A：250 μg/mL的b-TP-700作用于LNCaP細(xì)胞，并利用激光激發(fā)5 min;B：對(duì)照組沒(méi)有激光激發(fā)

2.4 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 250 μg/mL的b-TP-700+激光(1 W/cm,808 nm)照射組形成的腫瘤明顯小于LNCaP細(xì)胞組和250 μg/mL的b-TP-700處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LNCaP細(xì)胞組和250 μg/mL的b-TP-700處理組所形成的腫瘤大小差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

注：A：裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)所形成的腫瘤組織；B：裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

3 討論

我國(guó)前列腺癌發(fā)病率與病死率逐年增加，已成為威脅男性健康的主要疾病。2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，全球前列腺癌新發(fā)病例約130萬(wàn)，有35.9萬(wàn)人因前列腺癌而死亡。在世界范圍內(nèi)，前列腺癌的發(fā)病率僅次于肺癌[14]，占男性惡性腫瘤的第2位。因此，尋找一種有效的前列腺癌的治療方式顯得尤為重要。

光動(dòng)力療法是一種非常有前景的癌癥治療技術(shù)，近幾十年來(lái)得到了飛速發(fā)展而受到廣泛關(guān)注。光動(dòng)力療法主要從以下3個(gè)方面起到殺傷腫瘤細(xì)胞的效果：第一，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。光動(dòng)力療法通過(guò)直接作用于線粒體、細(xì)胞膜以及溶酶體發(fā)揮其腫瘤殺傷作用。光動(dòng)力療法作用于線粒體會(huì)促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，光動(dòng)力療法作用于溶酶體會(huì)促使細(xì)胞出現(xiàn)自噬，光動(dòng)力療法作用于細(xì)胞膜會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死。目前的研究結(jié)果顯示這幾種方式都參與了光動(dòng)力療法對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[15]。第二，光動(dòng)力療法產(chǎn)生的活性氧損傷腫瘤內(nèi)部血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血流停滯與滲漏，從而起到殺傷腫瘤的效果。第三，光動(dòng)力療法發(fā)揮作用過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致腫瘤免疫抑制，可以長(zhǎng)期抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在光動(dòng)力療法發(fā)揮殺傷腫瘤作用的過(guò)程中，光敏劑是光動(dòng)力療法發(fā)揮作用的基礎(chǔ)，其在特定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下起著能量傳遞的作用，進(jìn)而產(chǎn)生活性氧類(lèi)細(xì)胞毒性物質(zhì)。因此，光敏劑的優(yōu)劣是制約光動(dòng)力療法發(fā)展的關(guān)鍵因素。

近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，納米材料為光動(dòng)力學(xué)治療帶來(lái)了新的契機(jī)。納米材料是指介于1～100 nm的材料，因其特殊的尺寸而使其擁有更高的可塑性，在腫瘤治療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[16]。由于實(shí)體瘤血管壁間隙較寬、血管密集、淋巴回流受阻，對(duì)大分子物質(zhì)具有滯留性和選擇高通透性，而正常組織則恰恰相反[17]。實(shí)體瘤內(nèi)的這種現(xiàn)象被稱(chēng)為增強(qiáng)滲透與滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR)，可使納米材料進(jìn)入并停留于腫瘤組織[18]，屬于被動(dòng)靶向效應(yīng)。納米材料具有生物相容性，不會(huì)向免疫系統(tǒng)發(fā)出警報(bào)，并且可生物降解形成無(wú)害的代謝產(chǎn)物[19]。綜合以上納米材料的各種特性，奠定了納米材料在腫瘤治療領(lǐng)域的重要地位。

TiO2作為一種無(wú)機(jī)光敏劑，一直被用于紫外線光動(dòng)力治療癌癥[10-11]。然而，隨著研究的逐步深入，研究學(xué)者逐步發(fā)現(xiàn)紫外光產(chǎn)生的溫度過(guò)高[11]，而且紫外光穿透深度不足以及紫外光本身具有一定的毒性[13]，所以以TiO2作為光敏劑的光動(dòng)力學(xué)療法一直沒(méi)有應(yīng)用到臨床。針對(duì)以上困境，我們將TiO2經(jīng)過(guò)高溫煅燒，改變了其吸收光譜，我們稱(chēng)之為黑色TiO2。與之前的TiO2需利用紫外光激發(fā)相比，黑色TiO2利用近紅外光作為激發(fā)光解決了溫度過(guò)高、穿透深度過(guò)淺以及毒性等問(wèn)題，具有非常好的腫瘤治療前景。我們研制的黑色TiO2其吸收峰位于近紅外區(qū)600～800 nm之間(紅色到深紅色)，非常適宜做光動(dòng)力療法光敏劑。因?yàn)椴ㄩL(zhǎng)過(guò)高的激光能量較低不能激發(fā)氧分子最終形成ROS，而波長(zhǎng)過(guò)低的激光其穿透組織的深度則不夠(激光的波長(zhǎng)與其穿透組織的深度成正比)[20]。

首先我們利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黑色TiO2的毒性，從我們的CCK-8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出用含有不同濃度的黑色TiO2的培養(yǎng)液培養(yǎng)LNCaP細(xì)胞，前列腺癌LNCaP細(xì)胞的活力未見(jiàn)明顯的變化。這表明黑色TiO2本身沒(méi)有細(xì)胞毒性。從熒光顯微鏡的結(jié)果我們可以看出，黑色TiO2并不會(huì)引起細(xì)胞形態(tài)的改變。這也進(jìn)一步證明了黑色TiO2本身沒(méi)有細(xì)胞毒性。隨后我們研究發(fā)現(xiàn)利用808 nm的激光激發(fā)后，隨著黑色TiO2濃度的增加及激光照射的時(shí)間延長(zhǎng)，LNCaP的細(xì)胞活力明顯降低。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了黑色TiO2作為新型的光敏劑，在808 nm的激光激發(fā)下，通過(guò)光動(dòng)力學(xué)作用能明顯的殺傷腫瘤細(xì)胞，降低細(xì)胞的活力。為了進(jìn)一步探討黑色TiO2作為光敏劑通過(guò)光動(dòng)力學(xué)療法殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制，我們檢測(cè)了黑色TiO2作為光敏劑介導(dǎo)光動(dòng)力學(xué)治療過(guò)程中活性氧的產(chǎn)生量。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看出，利用808 nm激光激發(fā)黑色TiO2介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)治療過(guò)程中有大量的活性氧產(chǎn)生，這可能是黑色TiO2作為光敏劑通過(guò)光動(dòng)力學(xué)療法殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制之一。在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)利用黑色TiO2介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)療法處理過(guò)的LNCaP的成瘤能力明顯降低，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)水平驗(yàn)證了黑色TiO2作為光敏劑通過(guò)光動(dòng)力學(xué)療法殺傷腫瘤細(xì)胞的可行性，為前列腺癌的治療提供了一種新的思路、新的方法。

綜上所述，我們自主研發(fā)的黑色TiO2可以作為一種新型的無(wú)機(jī)光敏劑，其可以被808 nm激光激發(fā)，在黑色TiO2介導(dǎo)光動(dòng)力學(xué)療法過(guò)程中產(chǎn)生了大量的ROS，對(duì)前列腺癌細(xì)胞具有明顯的殺傷作用，有望成為一種新的、有效的前列腺癌的治療方法。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：課題設(shè)計(jì)：宮滿(mǎn)成、倪文君。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：宮滿(mǎn)成、董文靜。論文撰寫(xiě)及修改：宮滿(mǎn)成、董文靜、袁潤(rùn)強(qiáng)。