劉 倩，劉小杰

（上海城建職業(yè)學(xué)院，上海 201415）

水環(huán)境中細(xì)菌的快速檢測，一直是微生物學(xué)研究中的一個(gè)挑戰(zhàn)性課題，特別是對于含有復(fù)雜微生物種群的天然水體。由于飲用水中的貧營養(yǎng)環(huán)境有別于傳統(tǒng)培養(yǎng)基提供的富營養(yǎng)環(huán)境，大多數(shù)在顯微鏡下觀察到的飲用水中細(xì)菌不能在傳統(tǒng)培養(yǎng)基中生長，致使活菌計(jì)數(shù)結(jié)果偏低〔1-3〕。水體環(huán)境中污染物成分復(fù)雜，其中某些有機(jī)污染物會(huì)對附著其上的微生物產(chǎn)生持久性選擇壓力。近年來，飲用水中菌落總數(shù)快速檢測技術(shù)發(fā)展很快，比較成熟的有化學(xué)發(fā)光法、ATP 生物發(fā)光法、固相細(xì)胞計(jì)數(shù)法等〔4-5〕，但這些方法還存在一些弊端。

流式細(xì)胞儀具有較高的檢測靈敏度，可以用于檢測液態(tài)商品中的細(xì)菌總數(shù)和細(xì)菌種類等〔6〕。T. S.GUNASEKERA 等〔7〕實(shí)現(xiàn)了用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）快速檢測牛奶中的菌落總數(shù)，S.N.LANGERHUUS 等〔8〕利用流式細(xì)胞儀，檢測區(qū)分乳腺炎牛奶樣品中的革蘭氏陽性菌和陰性菌，C. QUIRóS 等〔9〕在酒類發(fā)酵過程中，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行了死活細(xì)胞的區(qū)分和酶活性的檢測。國內(nèi)諸多學(xué)者也開展了類似研究工作，大大擴(kuò)展了流式細(xì)胞儀的應(yīng)用范圍〔10-13〕。

FCM 利用熒光染料染色后與SYBR Green 結(jié)合，從背景信號(hào)中區(qū)分微小的微生物細(xì)胞。在系統(tǒng)中引入自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，閾值設(shè)置為SYBR Green-800（B530通道），采用50 μL 上樣體積，35 μL/min 的上樣速度，可以精確地確定細(xì)菌數(shù)量。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料和儀器

SYBR Green 染料（美國賽默飛世爾）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI，碧云天公司Beyotime C1005）；LB 培養(yǎng)基；平板計(jì)數(shù)瓊脂；實(shí)驗(yàn)室自備E.coli菌株。

0.1 μm 過濾器（美國密理博，SLW033LS）；流式細(xì)胞儀（美國安捷倫，NovoCyte）。

1.2 樣品處理

取12 支1.5 mL EP 管，分別標(biāo)記為1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024和2 048，其中2～2 048管中加入250 μL過濾后的超純水。1號(hào)管中加入500 μL水樣原液，從1 號(hào)管中取250 μL 水樣到2 號(hào)管中混勻。再從2 號(hào)管中取250 μL 水樣到4 號(hào)管中混勻，依次梯度稀釋下去。最終2 048 管中共有500 μL 水樣，移出250 μL 即可。

1.3 熒光染色

每個(gè)EP管中含250 μL水樣，加入5 μL SYBR Green染液，37 ℃水浴10 min，上機(jī)測試，未能馬上測試的樣本，置于4 ℃冰箱避光保存，2 h 內(nèi)完成測試〔14-15〕。

1.4 FCM 測定

采用安捷倫NovoCyte 流式細(xì)胞儀，50 μL 上樣體積，35 μL/min 的上樣速度，閾值設(shè)置為SYBR Green-800（B530 通道），使用自動(dòng)上樣器自動(dòng)采集上樣。測定細(xì)胞死活時(shí)，加入DAPI，稀釋1 000 倍，室溫染色5 min 上機(jī)。

1.5 平板計(jì)數(shù)法活菌計(jì)數(shù)

采用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)樣品中活性菌濃度，采用FCM 法分別統(tǒng)計(jì)樣品中活菌數(shù)、死菌數(shù)和細(xì)菌總數(shù)。平板計(jì)數(shù)法檢測：無菌操作吸取1 mL 水樣，注入一次性無菌平皿中，倒入46 ℃平板計(jì)數(shù)瓊脂，重復(fù)三次。同時(shí)在另一個(gè)平皿直接注入培養(yǎng)基做空白對照。將平板放置（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后計(jì)數(shù)。

1.6 FCM 與平板計(jì)數(shù)法的驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)GB 5749—2006 生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，微生物主要檢測指標(biāo)為總大腸菌群和菌落總數(shù)，因此本實(shí)驗(yàn)采用具有代表性的Escherichia coli斜面菌種。取E. coli斜面菌種1 支，無菌操作挑取菌苔，接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜后，作為菌懸液備用。用無菌移液槍移取1 mL 菌懸液于9 mL 蒸餾水樣中，作為樣品原液，用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）對樣品原液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度樣品分別進(jìn)行FCM 檢測和平皿計(jì)數(shù)檢測〔參見（GB 4789.2—2016）食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定〕〔16〕。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式體積法絕對計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性和線性范圍

調(diào)節(jié)熒光信號(hào)選擇合適的細(xì)胞群，圖1 顯示了各稀釋度下流式細(xì)胞儀測定圖譜，其中最后兩張圖是密度圖，樣本濃度高時(shí)，密度圖更容易看出分群情況。

圖1 各稀釋度下流式細(xì)胞儀測定圖譜Fig.1 Flow cytometer measurement chart at various dilutions

實(shí)驗(yàn)的濃度倍數(shù)、折算后濃度倍數(shù)以及折算后濃度倍數(shù)對應(yīng)的菌體絕對數(shù)見表1。

由表1 可知，1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024、2 048 這12 個(gè)管子測得的菌體絕對計(jì)數(shù)隨著稀釋倍數(shù)的增大而減少，通過數(shù)據(jù)分析對比，可以建立水樣FCM 快速檢測技術(shù)。

表1 濃度倍數(shù)、折算后濃度與對應(yīng)菌體的絕對計(jì)數(shù)Table 1 Concentration multiples，converted concentrations and absolute counts of corresponding bacteria

梯度稀釋流式體積法所得絕對計(jì)數(shù)與稀釋倍數(shù)的線性關(guān)系見圖2。

由圖2（a）可知，數(shù)據(jù)整體線性良好，圖2（b）為去掉原液和原液稀釋2 倍的數(shù)值，可以發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系更好，推測其原因?yàn)闈舛雀邥r(shí)，樣本會(huì)有抱團(tuán)。為證明此推測，對32 號(hào)和2 號(hào)管樣本進(jìn)行表征，結(jié)果見圖3。

圖2 菌體絕對計(jì)數(shù)與稀釋倍數(shù)的線性關(guān)系Fig.2 The linear relationship between the absolute count of bacteria and the dilution dilution times

由圖3 可知，濃度低時(shí)幾乎無抱團(tuán)現(xiàn)象，濃度高時(shí)會(huì)出現(xiàn)抱團(tuán)；低濃度時(shí)陰性和陽性區(qū)分良好，但高濃度樣本陽性群會(huì)左移，這是因?yàn)槿玖蠞舛纫欢?，?xì)菌數(shù)增多，而濃度不夠?qū)е滦盘?hào)偏弱。

圖3 高低濃度樣本抱團(tuán)圖譜Fig.3 Cluster map of high and low concentration samples

2.2 FCM 法測定活細(xì)菌濃度及總菌濃度

對水中進(jìn)行細(xì)菌總量計(jì)數(shù)，可以反映水環(huán)境指標(biāo)，根據(jù)GB 5749—2006 生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，菌落總數(shù)不得超過100 mL-1，目前采用的方法多為HPC法，但存在操作時(shí)間長，且檢測值比實(shí)際值低，有一定誤差，這可能是由于這些細(xì)菌是非異養(yǎng)型細(xì)菌、處于亞致死性損傷狀態(tài)或是活的，但處于不可以培養(yǎng)的狀態(tài)。流式細(xì)胞儀可以檢測飲用水中總菌數(shù)，更能反映真實(shí)細(xì)菌含量，在飲用水細(xì)菌計(jì)數(shù)方面，嚴(yán)心濤等〔17-19〕進(jìn)行了深入研究和探討，進(jìn)一步分析了飲用水安全。本研究在高濃度樣本中加入DAPI，結(jié)果見圖4，可以清楚地看出死亡的菌落數(shù)。

圖4 使用DAPI 檢測活性細(xì)菌和非活性細(xì)菌Fig.4 Use DAPI to detect active and inactive bacteria

2.3 FCM 法與平板計(jì)數(shù)法的準(zhǔn)確性

選取合適稀釋度樣品，分別進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，重復(fù)3 次，用3 次結(jié)果的常用對數(shù)值計(jì)算平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，對比流式細(xì)胞儀，所得結(jié)果見圖5，其相關(guān)性見圖6。

圖5 流式細(xì)胞儀與平板計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性比較Fig.5 Comparison of accuracy between flow cytometer and plate count

圖6 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)與平板計(jì)數(shù)相關(guān)性Fig.6 Correlation between flow cytometry and plate count

由圖5、圖6 可知，F(xiàn)CM 檢測與平板法檢測結(jié)果趨勢上基本一致，從數(shù)值上來看，流式細(xì)胞的檢測值都高于平板計(jì)數(shù)，對數(shù)值隨稀釋倍數(shù)基本成梯度變化。從數(shù)據(jù)分析可以看出，利用FCM 檢測水中的細(xì)菌總數(shù)與平板法檢測結(jié)果呈線性相關(guān)，〔R2＝0.991 9，相關(guān)程度為顯著相關(guān)（P＜0.01）〕，檢測結(jié)果的常用對數(shù)值基本一致，有很好的符合性。而1 024 管和2 048 管平板計(jì)數(shù)已無法計(jì)算對數(shù)值，這可能是因?yàn)槟承┘?xì)菌，雖然明顯存在，但沒有得到有效的培養(yǎng)，導(dǎo)致活菌計(jì)數(shù)結(jié)果偏低。

2.4 FCM 法與平板計(jì)數(shù)法的驗(yàn)證試驗(yàn)

將人工菌液分別以102～107mL-1的接種量添加到2048 號(hào)水樣中，分別用FCM 和平皿菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)的分析和計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖7，其相關(guān)性見圖8。

圖7 FCM 與平板計(jì)數(shù)法的驗(yàn)證試驗(yàn)Fig.7 Validation test of flow cytometer and plate colony counting method

圖8 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)與平板計(jì)數(shù)相關(guān)性Fig.8 Correlation between flow cytometry and plate count

由圖7、圖8 可知，隨菌液濃度梯度的增加，F(xiàn)CM與平板計(jì)數(shù)的檢測結(jié)果基本一致。FCM 與平板計(jì)數(shù)法檢測水樣中細(xì)菌總數(shù)的結(jié)果呈正的直線相關(guān)（P<0.01），相關(guān)程度為顯著相關(guān)（R2=0.996 9）。FCM檢測到的對數(shù)值高于平板計(jì)數(shù)法，因此比平板計(jì)數(shù)法更加精確，這可能是因?yàn)榱魇郊?xì)胞儀是對每一個(gè)被熒光染色的目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)〔6〕。

3 結(jié)論

流式細(xì)胞儀可快速高通量對細(xì)菌進(jìn)行絕對計(jì)數(shù)，無需計(jì)數(shù)微球，節(jié)省成本，且流式細(xì)胞儀檢測線性范圍寬，靈敏度高。本研究利用流式細(xì)胞儀，對環(huán)境水中細(xì)菌總數(shù)測定方法進(jìn)行了研究，建立了FCM檢測環(huán)境水中細(xì)菌總數(shù)的方法，利用SYBR Green 和DAPI 可以檢測活菌和死亡的菌體，更能反應(yīng)出實(shí)際細(xì)菌總數(shù)，同時(shí)與國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法進(jìn)行了比較，驗(yàn)證了其準(zhǔn)確性和靈敏度，檢測的結(jié)果更準(zhǔn)確，更可靠。