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七氟烷后處理對(duì)原代海馬神經(jīng)元氧糖剝奪/復(fù)氧損傷及自噬的影響

2022-06-02 08:32王佳楠黃春霞胡憲文
關(guān)鍵詞:后處理線粒體海馬

王佳楠,黃春霞,胡憲文

在臨床上,急性缺血性腦病的發(fā)病率、致殘率、病死率很高。腦缺血可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷甚至死亡,造成不可逆的損傷[1]。臨床治療腦缺血的有效方法是盡快恢復(fù)血液灌注。再灌注后缺血區(qū)組織血供恢復(fù)但組織損傷加重的現(xiàn)象被稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)[2]。有研究[3]報(bào)道,在腦組織特別是海馬中氧與三磷酸腺苷儲(chǔ)存較少,海馬神經(jīng)元對(duì)線粒體功能障礙和線粒體活性氧增加敏感,對(duì)能量缺乏的耐受性較差,海馬神經(jīng)細(xì)胞極易因缺血再灌注受損。CIRI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其機(jī)制涉及線粒體功能障礙、自噬、自由基損傷、鈣超載、炎癥損傷、神經(jīng)細(xì)胞凋亡。自噬是一種細(xì)胞自降解過(guò)程,能夠降解和回收胞內(nèi)組分,被證實(shí)與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),包括神經(jīng)退行性疾病、癌癥、自身免疫性疾病。

七氟烷是一種臨床上廣泛應(yīng)用的吸入性麻醉藥,既往研究[4]表明,七氟烷后處理對(duì)CIRI有神經(jīng)保護(hù)作用,可以減少腦梗死面積。本課題組前期研究[5]表明七氟烷后處理可通過(guò)增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),降低促凋亡蛋白Bax、細(xì)胞色素C、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)的表達(dá),減少海馬神經(jīng)元丟失,從而抑制細(xì)胞凋亡,對(duì)大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用。但七氟烷后處理對(duì)腦自噬的影響還不清楚。故擬研究七氟烷后處理對(duì)原代海

馬神經(jīng)元氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen - glucose deprivation / reoxygenation, OGD/R)后損傷凋亡,線粒體氧化應(yīng)激及自噬的影響,探討七氟烷后處理腦保護(hù)作用的相關(guān)分子機(jī)制,為臨床治療CIRI提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SPF級(jí)雄鼠和雌鼠由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(皖)2017-006。

1.1.2主要試劑 胎牛血清(貨號(hào):S711-001S)購(gòu)自上海Lonsera 公司;DMEM-12細(xì)胞培養(yǎng)液(貨號(hào):11330500BT)、Neurobasal Medium(貨號(hào):21103-049)、 0.25%胰蛋白酶(貨號(hào):25200056)、GlutaMAX (貨號(hào):35050-061)、B27 (貨號(hào):17504-044)、青鏈霉素 (貨號(hào):15140122)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;5-氟-2′-脫氧尿嘧啶核苷(貨號(hào):F0503)、多聚賴氨酸 (貨號(hào):P1399)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Parkin抗體(貨號(hào):2132S)、 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(Microtubule-associated protein 1 light chain 3B, LC3B)抗體(貨號(hào):3868S) 、活化的半胱氨酸蛋白酶3 (cleaved caspase-3)抗體(貨號(hào):9661S)均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司;絲氨酸/蘇氨酸激酶(PTEN induced putative kinase 1, PINK1)抗體(貨號(hào):sc-517353)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Blotechnology公司;線粒體超氧化物指示劑(MitoSOX,貨號(hào):M36008)購(gòu)自美國(guó) invitrogen公司 ;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào): P0012)、 RIPA裂解液(貨號(hào):P0013K)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;七氟烷(貨號(hào): 83291)購(gòu)自美國(guó)艾伯維公司;原位末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào): 12156792910)購(gòu)自美國(guó)Roche公司;ECL顯影液(貨號(hào):32109)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司; 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)測(cè)定試劑盒(貨號(hào):A020)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.3主要儀器 缺氧小室(加拿大Stem Cell公司);七氟烷蒸發(fā)罐(德國(guó)Drager公司);熒光顯微鏡(日本Olympus 公司);Tanon Fine Do X6 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海 Tannon 公司);Tecan M 1000 酶標(biāo)儀(德國(guó) Tecan 公司);37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Sigma 公司)。

1.2 方法

1.2.1原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞提取及培養(yǎng) 雌雄大鼠交配,以雌性大鼠出現(xiàn)陰道栓日計(jì)算胎齡,提取自孕鼠子宮內(nèi)胎齡(18±0.5)d胎鼠海馬組織。根據(jù)文獻(xiàn)方法[6],用75%乙醇消毒器械及孕鼠腹部,“V”字形剪開腹部,取出胚胎,斷頭取腦,放入預(yù)冷的無(wú)菌平衡鹽溶液中,顯微鏡下分離海馬組織,0.25% 胰蛋白酶消化10 min左右,加入培養(yǎng)基(90% DMEM-F12+10%胎牛血清 )終止消化5 min,3 000 r/min、離心5 min,棄上清液后,加入培養(yǎng)基(88% DMEM-F12+1%青鏈霉素+1% Glutamax+10%胎牛血清),制成細(xì)胞懸液,種植于多聚賴氨酸包被的玻片中,放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后培養(yǎng)基全部換成細(xì)胞維持液(96% Neurobasal Medium+2% B27+1% Glutamax+1%青鏈霉素),再加入5-氟-2′-脫氧尿嘧啶核苷(40 μmol/L)抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。每3 d更換培養(yǎng)液的1/3。培養(yǎng)至第7 天,神經(jīng)元已經(jīng)基本上發(fā)育成熟。

1.2.2建立細(xì)胞OGD/R損傷模型 參照文獻(xiàn)方法[7],將原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞正常培養(yǎng)時(shí)的完全培養(yǎng)基換為無(wú)血清無(wú)糖的平衡液(139 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、0.5 mmol/L MgCl2、1.0 mmol/L CaCl2、5 mmol/L HEPES,pH 7.4),細(xì)胞置于缺氧小室中,通入95% N2+5% CO2氣體10 min 以驅(qū)除小室內(nèi)的氧氣,隨后將缺氧小室放入 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h 進(jìn)行氧糖剝奪處理,然后用完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行復(fù)氧復(fù)糖。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及處理 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)已經(jīng)基本發(fā)育成熟,對(duì)能量缺乏敏感。將細(xì)胞隨機(jī)分為3組: 對(duì)照組(CON組),原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞置于培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng);氧糖剝奪/復(fù)氧組(OGD/R組),將原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行1.5 h氧糖剝奪和24 h復(fù)氧復(fù)糖處理;七氟烷后處理組(OGD/R+SEVO組),原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪處理后,缺氧小室內(nèi)預(yù)充濃度2.4%七氟烷6 min,然后密閉缺氧小室培養(yǎng)1 h ,后置于37 ℃, 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)23 h。

1.2.4檢測(cè)細(xì)胞LDH活性 完成以上分組及處理后,每組各取40 μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液,嚴(yán)格按照LDH試劑盒說(shuō)明書操作,利用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔吸光度值,然后根據(jù)公式計(jì)算各組培養(yǎng)液中LDH活性,以反映神經(jīng)元的損傷程度。

1.2.5MitoSOX染色 培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)處理后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)洗滌,在培養(yǎng)皿中加入MitoSOX與培養(yǎng)基混合物,37 ℃ 黑暗條件下孵育20 min。用PBS洗滌2次,將爬片撈出,用抗淬滅劑封片后固定至載玻片,用熒光倒置顯微鏡獲得圖像,統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度,以其反映線粒體活性氧水平。

1.2.6TUNEL染色 用PBS洗滌兩次爬片,在樣品上加入50 μl TUNEL反應(yīng)混合物。為了確保TUNEL反應(yīng)混合物在細(xì)胞單層間均勻擴(kuò)散,并避免蒸發(fā)損失,樣品在孵化過(guò)程中應(yīng)覆蓋副膜。在37 ℃黑暗條件下,在加濕氣氛中孵育60 min。用PBS洗滌玻片3次。采用共聚焦顯微鏡獲得圖像。

1.2.7免疫熒光 處理結(jié)束后的細(xì)胞用PBS沖洗,使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞形態(tài)10 min,使用含有0.1%Triton X-100和1%牛血清白蛋白的PBS溶液通透并封閉細(xì)胞120 min,4 ℃過(guò)夜孵育一抗:兔抗LC3B (1 ∶200)。細(xì)胞在室溫下與相應(yīng)的二抗孵育2 h。PBS洗滌后,用含細(xì)胞核標(biāo)記物(DAPI)的抗淬滅劑封片后,指甲油將爬片固定至載玻片,采用共聚焦顯微鏡獲得圖像。

1.2.8Western blot 取處理結(jié)束后的原代海馬神經(jīng)元加入RIPA裂解液充分反應(yīng)30 min,13 200 r/min離心30 min后取上清液,檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白濃度,加入上樣緩沖液,100 ℃煮10 min。 蛋白樣品用SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)膜,室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h, 含Tris緩沖液(TBST)洗滌2次,加一抗4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗滌3次,加二抗室溫孵育1 h,TBST洗滌3次后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá),采用Image J軟件計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參灰度值。

2 結(jié)果

2.1 七氟烷后處理對(duì)原代海馬神經(jīng)元LDH釋放的影響與CON組相比,OGD/R組原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)液中LDH活性增加(F=23.12,P<0.01);與OGD/R組相比,OGD/R+SEVO組LDH活性降低(F=15.30,P<0.05)。見圖1。

圖1 七氟烷后處理對(duì)原代海馬神經(jīng)元LDH釋放的影響a: CON組; b: OGD/R組; c: OGD/R+SEVO組; 與CON組比較:**P<0.01;與OGD/R組比較:#P<0.05

2.2 七氟烷后處理對(duì)原代海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激的影響與CON組相比,OGD/R組線粒體活性氧增多(F=24.41,P<0.01);與 OGD/R組相比,OGD/R+SEVO組線粒體活性氧減少(F=17.38,P<0.05)。見圖2。

圖2 七氟烷后處理對(duì)原代海馬神經(jīng)元線粒體活性氧的影響a: CON組; b: OGD/R組; c: OGD/R+SEVO組;與CON組比較:**P<0.01;與OGD/R組比較:#P<0.05

2.3 七氟烷后處理對(duì)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響與CON組相比,OGD/R組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和cleaved caspase-3表達(dá)量增多;與 OGD/R組相比,OGD/R+SEVO組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和cleaved caspase-3表達(dá)量減少。見圖3。

圖3 TUNEL法檢測(cè)七氟烷后處理對(duì)原代海馬神經(jīng)元凋亡的影響A:Merge ×200;B:TUNEL ×600;C:cleaved caspase-3 ×600;D:Merge ×600

2.4 七氟烷后處理對(duì)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞自噬的影響采用免疫熒光染色檢測(cè)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞LC3B的表達(dá)水平。LC3B蛋白熒光染色結(jié)果如圖4所示,與CON組相比,OGD/R組LC3B蛋白的表達(dá)增多(F=6.97,P<0.01);與OGD/R組相比,OGD/R+SEVO組LC3B蛋白減少(F=4.74,P<0.05)。用Western blot檢測(cè)細(xì)胞PINK1和Parkin蛋白表達(dá),結(jié)果如圖 5所示,與CON組相比,OGD/R 組PINK1的表達(dá)增多(F=19.30,P<0.001),Parkin的表達(dá)增多(F=5.26,P<0.05);與OGD/R 組相比,OGD/R+SEVO組PINK1的表達(dá)減少(F=14.80,P<0.01),Parkin 的表達(dá)也降低(F=5.65,P<0.05)。

圖4 七氟烷后處理對(duì)原代海馬神經(jīng)元LC3B蛋白表達(dá)的影響A:免疫熒光法檢測(cè)LC3B ×120;B:原代海馬神經(jīng)元中LC3B的表達(dá)變化;a: CON組;b:OGD/R組;c:OGD/R+SEVO組;與CON組比較:**P<0.01;與OGD/R組比較:#P<0.05

圖5 七氟烷后處理對(duì)原代海馬神經(jīng)元PINK1、Parkin蛋白的影響A:Western blot檢測(cè)PINK1、Parkin;B:原代海馬神經(jīng)元中PINK1、Parkin的表達(dá)變化;a:CON組;b:OGD/R組;c:OGD/R+SEVO組;與CON組比較:*P<0.05,***P<0.001;與OGD/R組比較:#P<0.05,##P<0.01

3 討論

腦組織尤其海馬區(qū)域因供能方式單一對(duì)能量缺乏非常敏感,極易因缺血再灌注受損。腦缺血再灌注的潛在病理改變與炎癥、氧化應(yīng)激、自噬密切相關(guān),這些改變最終可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死。臨床上,麻醉和手術(shù)中遇到的失血性休克與復(fù)蘇事件非常常見,故找到一種有效且切實(shí)可行的方法來(lái)減輕CIRI具有非常重要的臨床意義。

課題組前期研究[8]表明2.4%七氟烷后處理可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡改善大鼠失血性休克和復(fù)蘇損傷后的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙。有研究[9]表明七氟烷后處理可以減輕HT22細(xì)胞OGD/R損傷及凋亡程度。故研究采用(18±0.5)d孕鼠子宮內(nèi)胎鼠進(jìn)行體外原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng),其對(duì)氧糖剝奪敏感性高[10]。對(duì)培養(yǎng)7 d的原代海馬神經(jīng)元進(jìn)行OGD/R處理,以此模擬體內(nèi)腦缺血再灌注過(guò)程。本研究通過(guò)此體外模型進(jìn)行七氟烷保護(hù)作用機(jī)制的驗(yàn)證與探索。OGD/R處理后神經(jīng)元LDH釋放及凋亡細(xì)胞數(shù)量均增加,說(shuō)明OGD/R模型建立成功。經(jīng)過(guò)2.4%的七氟烷處理后LDH釋放減少,證實(shí)采用的七氟烷后處理可減輕OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。在實(shí)驗(yàn)中七氟烷后處理可以降低OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體活性氧的生成,降低神經(jīng)元氧化應(yīng)激水平,改善線粒體功能。TUNEL和cleaved caspase-3染色證明七氟烷后處理可以減輕OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,改善凋亡早期的DNA斷裂。此次體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)七氟烷后處理可以減少OGD/R后的細(xì)胞損傷和凋亡,改善線粒體損傷。

目前越來(lái)越多的研究關(guān)注自噬在缺血/再灌注中的病理生理過(guò)程。自噬作為一種機(jī)體自我防御的機(jī)制,在缺血再灌注誘導(dǎo)的腦損傷中起著重要作用。在體外氧糖剝奪條件下,自噬是通過(guò)自噬體包裹損壞的蛋白及細(xì)胞器,將其送入溶酶體降解,提高自噬水平從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷。有體外研究[11]證明,七氟烷后處理通過(guò)減少自噬體形成,增加自噬體的清除率而有助于細(xì)胞保護(hù)。LC3B是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中常見的自噬小體的標(biāo)志蛋白。有研究[12]表明細(xì)胞在能量底物缺乏的情況下,會(huì)產(chǎn)生過(guò)度自噬的激活。本研究中OGD/R處理后神經(jīng)元LC3B表達(dá)增多,神經(jīng)元自噬過(guò)度激活。而七氟烷后處理可以減輕OGD/R所致的過(guò)度自噬。在細(xì)胞發(fā)生自噬的過(guò)程中,多種途徑被激活發(fā)揮作用。PINK1/Parkin可以通過(guò)對(duì)受損線粒體的識(shí)別來(lái)啟動(dòng)及擴(kuò)大自噬信號(hào),是目前較公認(rèn)的自噬途徑,被廣泛用來(lái)評(píng)估自噬水平[13]。本研究表明,OGD/R處理后神經(jīng)元PINK1、Parkin蛋白表達(dá)量增多,而七氟烷處理后這兩種蛋白表達(dá)量降低,證明七氟烷后處理可以減輕OGD/R所致的過(guò)度自噬,且這種作用可能與PINK1/Parkin通路有關(guān)。

綜上,研究表明七氟烷后處理可以通過(guò)減少OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞過(guò)度自噬、減輕氧化應(yīng)激、減少凋亡等途徑來(lái)保護(hù)原代海馬神經(jīng)元,且降低自噬的機(jī)制可能與PINK1/Parkin通路有關(guān)。該研究證實(shí)了七氟烷后處理對(duì)CIRI中神經(jīng)元的保護(hù)作用,探討了七氟烷后處理對(duì)CIRI中神經(jīng)元自噬的影響。但該研究只初步探討了可能的分子機(jī)制,沒有應(yīng)用PINK1/Parkin通路抑制劑進(jìn)行進(jìn)一步證明,需在后續(xù)的研究中進(jìn)一步深入研究其具體機(jī)制,為臨床治療CIRI提供潛在的分子靶點(diǎn)。

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