李 玉，張鳳翔（通訊作者），張 芳

（1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 014000；2.鄂爾多斯市中心醫(yī)院 影像科，內(nèi)蒙古 017000）

直腸癌因其高發(fā)病率和高死亡率已經(jīng)成為當(dāng)今關(guān)系公共衛(wèi)生健康的重要問題。分子細胞學(xué)知識的進步以及生物標志物的檢測對腫瘤預(yù)測、早期診斷和改善預(yù)后非常重要［1］，一個可靠的生物學(xué)指標對協(xié)助臨床進行精準治療大有裨益［2］。Ki67是已知的直腸癌中預(yù)測腫瘤行為和預(yù)后的可靠指標，Ki67的高表達與直腸癌的侵襲性和預(yù)后不良密切相關(guān)［3］。然而，有創(chuàng)性的組織免疫學(xué)檢測難以重復(fù)，且活檢樣本可能因為采樣的條件、技術(shù)等外在因素的影響而不能全面反映腫瘤表達的異質(zhì)性。DCE-MRI圖像清晰，且定量分析可以評價腫瘤組織的灌注及滲透特性，因此在科研與臨床工作中廣泛應(yīng)用［4］。本文旨在探究DCE-MRI定量參數(shù)Ktrans值、Kep值和Ve值與直腸癌分化程度及生物學(xué)指標Ki67表達高低之間的關(guān)系，探究通過無創(chuàng)方式反映腫瘤的病理進展?fàn)顟B(tài)，為協(xié)助臨床診療及預(yù)后評價提供一定的指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究收集2020年10月至2021年12月于鄂爾多斯市中心醫(yī)院行DCE-MRI掃描的直腸腺癌患者43例，其中男 28例，女15例，年齡（67±11.4）歲，其中高分化組16例、中分化組21例、低分化組6例。納入標準：①檢查前未進行放化療；②術(shù)后病理學(xué)診斷為直腸腺癌；③檢查后一周內(nèi)行直腸癌根治術(shù)，且術(shù)后病理資料完整。排除標準：①圖像質(zhì)量差，無法進行后處理者；②有MRI檢查禁忌癥者；③腫瘤體積太小無法準確測量者。

1.2 MRI檢查方法

告知患者提前做好腸道清潔準備，檢查前5分鐘內(nèi)通過注射鹽酸消旋山莨菪堿20mg抑制腸道蠕動，避免運動偽影造成的影響。采用HDXT GD 3.0T磁共振掃描儀及腹部線圈，患者取仰臥位，DCEMRI掃描前行MRI常規(guī)平掃。掃描序列如下：①軸位 T1WI：TR550ms、TE8.9ms、FOV46x46cm、 層 厚6mm； ② 軸 位 抑 脂 T2WI：TR5280ms、TE140ms、FOV46x46cm、層厚 6mm；③冠狀位抑脂 T2WI：TR5640ms、TE110ms、FOV43x45cm、層厚 5mm；④矢狀 位 T2WI：TR5220ms、TE109ms、FOV32x32cm、 層厚 5mm； ⑤ T2WI 小 FOV：TR5220ms、TE109ms、FOV32x32cm、層厚 3mm；⑥軸位 DWI：TR5000ms、TE94.2ms、b=800s/mm2、FOV40x 40cm、 層 厚 6mm。DCE-MRI動態(tài)增強掃描，采用美國GE公司的LAVA序列。 參數(shù)如下：TE1.1ms，TR2.9ms，F(xiàn)OV40x40cm，層厚3.6mm。以病變?yōu)橹行膾呙?個蒙片（反轉(zhuǎn)角度為3°，6°，9°，12°，15°）后，以 12°翻轉(zhuǎn)角進行動態(tài)增強掃描，應(yīng)用磁共振專用高壓注射器通過肘靜脈套管（20G）團注美國GE藥業(yè)的造影劑歐乃影（釓雙胺注射液），劑量為 0.2mmol/kg，速率為 3.5ml/s，注射完畢后緊接追加20ml生理鹽水沖管，對比劑注射同時連續(xù)進行40個期相的動態(tài)增強掃描。總掃描時間為7分5秒。

1.3 圖像分析及處理

使用OmniKinetics軟件對DCE-MRI定量參數(shù)Ktrans值、Kep值和Ve值進行統(tǒng)計分析。獲取動脈輸入函數(shù)（Arterial Input Function，AIF）曲線模型，以病灶強化最為明顯的區(qū)域為中心，手動繪制病灶感興趣 區(qū) （Region Of Interest，ROI），ROI 大 小 約 3.0-3.5cm2，且每個ROI測量3-5次取平均值。采用Extended Tofts Linear雙室模型，獲得Ktrans（容積轉(zhuǎn)運常數(shù)）、Kep（速率常數(shù)）、Ve（細胞外間隙分數(shù)）的參數(shù)圖譜，并自動生成Excel表格，最后整理數(shù)據(jù)。以上所有DCE-MRI定量資料的分析獲取均由2名中級以上影像科醫(yī)師各自獨立分析完成后取平均值。見圖1。

圖1 患者男，65歲，腸鏡提示直腸癌，病理提示中分化腺癌。1A：T2WI圖像示直腸左前壁不均勻增厚 ；1B：Ktrans偽彩圖，病變區(qū)Ktrans=0.750/min ；1C：Kep偽彩圖，病變區(qū)Kep=0.458/min ；1D：Ve偽彩圖，病變區(qū)Ve=0.631

1.4 免疫組化檢測Ki67

將取下的腫瘤標本于福爾馬林溶液固定后，采用石蠟包埋組織切片（4μm）用二甲苯預(yù)處理，梯度酒精水化。待應(yīng)用pH值為6.0的檸檬酸鹽緩沖液沖洗切片后進行烘干冷卻。然后在室溫下應(yīng)用磷酸鹽緩沖鹽水清洗后加入抗體、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑、蘇木精復(fù)染色等完成切片染色。Ki67陽性的定位位于細胞核，顯示為在相應(yīng)部位呈現(xiàn)棕黃色顆粒。隨機選取5個高倍鏡視野（×400）進行陽性細胞率的計算，同一視野中陽性細胞數(shù)與1 000個癌細胞之間的百分比為其增殖指數(shù)。最終的結(jié)果評定標準為［5］：鏡檢細胞中若Ki67陽性細胞數(shù)<10%為陰性（-），10%～50%為陽性（+），陽性細胞率>50%為強陽性（++）。且將其分為兩組，其中Ki67低于50%的列為低表達組，高于50%的列為高表達組。見圖2。

圖2 直腸癌組織中Ki67表達 （免疫組化×200）A：Ki67高表達；B：Ki67低表達

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理使用Rstudio軟件進行分析，使用ggplot2、ggsignif、pROC包繪圖。所有計數(shù)資料待驗證其正態(tài)性后，將符合正態(tài)分布的計量資料采用±s進行統(tǒng)計學(xué)描述；Ki67高表達組和低表達組之間的數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗的方式進行統(tǒng)計學(xué)分析；直腸癌高分化組、中分化組、低分化組組間比較采用Mann-Whithey U檢驗的方式進行統(tǒng)計學(xué)分析；比較不同DCE-MRI定量參數(shù)對診斷Ki67表達的靈敏度、特異度，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分化程度與DCE-MRI定量參數(shù)的關(guān)系

在直腸癌不同分化程度的組間比較中（見表1），Ktrans值存在統(tǒng)計學(xué)差異 （F=5.969，P=0.005），Kep值和 Ve值無統(tǒng)計學(xué)差異 （F=1.111，P=0.339；F=0.121，P=0.886）。直腸癌高分化組的 Ktrans值為0.378±0.261/min，直腸癌中分化組的 Ktrans值為 0.742±0.627/min，直腸癌低分化組的 Ktrans值為 1.143±0.336/min。其中，高分化組Ktrans明顯低于中分化組及低分化組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P=0.029，P=0.002）；而中分化組和低分化組之間的Ktrans無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.082）（見圖 3）。

圖3 直腸癌不同分化組DCE-MRI定量參數(shù)Ktrans箱圖

表1 不同分化程度直腸癌的DCE-MRI定量參數(shù)比較（±s）

表1 不同分化程度直腸癌的DCE-MRI定量參數(shù)比較（±s）

變量 高分化組 中分化組 低分化組 F P Ktrans0.378±0.261 0.742±0.627 1.143±0.336 5.969 0.005 Kep 0.344±0.251 0.363±0.244 0.521±0.309 1.111 0.339 Ve 0.421±0.611 0.454±0.373 0.349±0.194 0.121 0.886

2.2 Ki67表達水平與DCE-MRI定量參數(shù)的關(guān)系

在 Ki67 低表達組（n=16）和高表達組（n=27）的比較中，兩組間Ktrans和Kep值存在統(tǒng)計學(xué)差異 （t=2.682，P=0.014；t=2.386，P=0.0023）， 兩組間的 Ve值無統(tǒng)計學(xué)差異（t=-0.135，P=0.800）。 Ki67高表達組的Ktrans值及Kep值顯著高于低表達組且差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 不同Ki67表達水平的DCE-MRI定量參數(shù)比較（±s）

表2 不同Ki67表達水平的DCE-MRI定量參數(shù)比較（±s）

變量 ki67高表達組 ki67低表達組 F P Ktrans 0.822±0.598 0.460±0.382 2.692 0.014 Kep 0.451±0.257 0.286±0.230 2.386 0.023 Ve 0.394±0.356 0.379±0.225 -0.135 0.800

2.3 DCE-MRI的定量參數(shù)對直腸癌腫瘤細胞中Ki67表達水平的ROC曲線分析

ROC曲線分析顯示，Ki67兩組間診斷Ktrans值的臨界值為0.675/min，靈敏度和特異度分別為73%、41%；兩組間Kep值的臨界值為0.214/min，靈敏度和特異度分別為87%、53%。Ki67兩組間診斷Ve值靈敏度及特異度均較低（46%，37%），見表3。

表3 不同Ki67表達水平的DCE-MRI定量參數(shù)效能分析

3 討論

動態(tài)增強磁共振（DCE-MRI）的工作原理是通過靜脈注射順磁性釓類造影劑后，在規(guī)定時間內(nèi)掃描出多期圖像，進而從影像的不同表現(xiàn)中研究器官或腫瘤組織中造影劑的攝取情況［6］。因為造影劑的攝取量取決于微循環(huán)，所以將圖像經(jīng)過處理后可獲得與微循環(huán)相關(guān)的灌注參數(shù)［7］。Ktrans（min-1）是指體積轉(zhuǎn)移常數(shù)，它描述的是造影劑從血漿轉(zhuǎn)移到組織的速率，間接反映腫瘤局部微血管的血流狀態(tài)及通透表面積。Kep（min-1）是指轉(zhuǎn)移速率常數(shù)，它描述了造影劑從血管外細胞外間隙到血漿室的回流速率，間接反映腫瘤微血管的生長狀態(tài)。Ve（%）是指從血管外細胞外間隙滲透到血漿室中的部分體積，其大小代表EES中對比劑的容量，反映腫瘤細胞的增殖及壞死情況［8］。

DCE-MRI作為新興的現(xiàn)代化影像技術(shù)，可以綜合組織形態(tài)學(xué)和血流動力學(xué)變化的特征，從而進一步評估腫瘤的分化程度［9］。從本研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，直腸癌高分化組的Ktrans值顯著低于中、低分化組，很有可能是因為分化程度低的腫瘤因組織缺氧情況嚴重，進而刺激血管進入再生狀態(tài)，灌注量明顯增加，血管滲透面積隨之增大。除此之外，分化程度低的腫瘤在細胞形態(tài)學(xué)和組織學(xué)上均表現(xiàn)出更高的異質(zhì)性。由于細胞密度的增高，細胞間質(zhì)變小，因而Ktrans值更高。本研究中的Kep值和Ve值與腫瘤分化程度高低均沒有明顯相關(guān)性，這與Shen等（2016）［9］研究結(jié)果相一致。雖然Kep值和Ve值與腫瘤的血管外、細胞外空間組成有關(guān)，但在不同分化狀態(tài)的病變中，血管外、細胞外空間的組成并沒有明顯差異。Ki67是一項反映細胞增殖的標志物，在細胞分裂進展中起到重要作用，且其表達的高低程度與細胞增殖高度相關(guān)［10-11］。本研究結(jié)果顯示，Ki67高表達組的Ktrans值、Kep值均高于低表達組的值，但Ve值的高低與腫瘤細胞中Ki67表達的多少無明顯相關(guān)性。Ki67高表達提示腫瘤增殖更加活躍，微血管增多，微循環(huán)加速，因此Ktrans、Kep值升高。本研究DCEMRI定量參數(shù)的ROC曲線分析顯示，Ktrans、Kep對評估直腸癌Ki67表達程度具有較高的靈敏度，可為直腸癌ki67表達程度提供參考。當(dāng)然，本研究也存在一定的不足。首先，進行收集且符合入組標準的樣本量偏少。其次，Ki67表達程度需進一步細化分組，進行與DCE-MRI定量參數(shù)的相關(guān)性研究。這些不足可能會對結(jié)果造成偏倚。后續(xù)為了確保DCEMRI定量參數(shù)在直腸癌診療中的可參考性，還需要對大量樣本進行研究。

綜上所述，DCE-MRI定量分析彌補了常規(guī)磁共振只進行形態(tài)學(xué)評估的不足，能在一定程度上無創(chuàng)地反映直腸癌分化程度和Ki67表達情況，為臨床診療提供依據(jù)。