李咪咪，龍虎，陳煉紅

(西南民族大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

牦牛乳營養(yǎng)價值高，乳中含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、非脂乳固體、礦物質(zhì)等，其含量均比其他牛乳高[1]。牦牛乳發(fā)酵制得的牦牛酸乳因其特有的風(fēng)味而受到歡迎，酸乳中富含乳酸、氨基酸、不飽和脂肪酸等物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)人體腸道菌群、促進(jìn)腸道蠕動、調(diào)節(jié)血壓、降低膽固醇等功能[2]。酸乳中的微生物具有多樣性，其中以乳酸菌為優(yōu)勢菌群，同時還存在酵母菌和醋酸桿菌，丁武蓉[3]、張和平[4]均在自然發(fā)酵乳制品的研究中發(fā)現(xiàn)并分離得到醋酸桿菌。

醋酸菌(acetic acid bacteria)是食醋發(fā)酵生產(chǎn)過程中的主要產(chǎn)酸菌，是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，能夠?qū)⒁掖佳趸梢宜幔摼畛鮼碓从趥鹘y(tǒng)發(fā)酵釀醋中[5-6]。若使醋酸菌生長繁殖良好，除了提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)即六大營養(yǎng)素之外，還要提供合適的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)溫度、乙醇濃度和pH等[7-8]，改變這些培養(yǎng)條件，會導(dǎo)致醋酸菌發(fā)生變形甚至死亡。利用菌株形態(tài)觀察和生理生化特性的鑒定方法不能準(zhǔn)確地鑒定醋酸菌，其原因是醋酸菌各種屬間菌株的菌落形態(tài)和生理生化特性區(qū)別較不明顯，因此若要準(zhǔn)確鑒定醋酸菌到菌種，還需對菌株進(jìn)行基因測序相結(jié)合。

本研究以從牦牛乳中分離得到的一株疑似醋酸菌的菌株為試驗(yàn)材料，根據(jù)其形成菌膜的特性，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征鑒定和16S rRNA序列分析方法，鑒定其歸屬。再對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以乙醇濃度、培養(yǎng)溫度、pH值和培養(yǎng)基為影響因素，利用正交試驗(yàn)尋找該菌株最佳的產(chǎn)酸培養(yǎng)條件,為新醋研發(fā)提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

1.1.1 菌株來源

從高原牦牛乳中分離出一株菌，編號CS-63，保存于西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院102實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

1%酵母浸提物、1%葡萄糖、0.05% MgSO4、0.01% ZnSO4、0.1% K2HPO4。

1.1.2.2 YPG培養(yǎng)基

0.5%酵母浸提物、0.3%葡萄糖、0.2%蛋白胨、pH 6.8。

1.1.2.3 發(fā)酵液體培養(yǎng)基

1%酵母浸提物、1%葡萄糖、0.3%蛋白胨。

1.1.2.4 平板培養(yǎng)基

1%酵母浸提物、1%葡萄糖、1%碳酸鈣、2%瓊脂、pH 4.5，使用前加3%無水乙醇。

1.2 常用試劑與儀器

NaOH、HCl、酚酞試劑、無水乙醇、FeCl3：成都康迪生物技術(shù)有限公司。

PL-303型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-IF型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；UV-6100型分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)公司；凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；TC-512 PCR型擴(kuò)增儀 英國Techne公司；804R型冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；LX-B35L型高壓滅菌鍋 深圳市佳博特實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 醋酸菌菌落形態(tài)觀察

在無菌條件下，取1 mL樣品在9 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液中稀釋10倍，充分混勻，以10倍稀釋法對其進(jìn)行梯度稀釋。待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，向直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)倒入20～25 mL，待冷凝后，吸取1 mL的 10-5,10-6,10-7稀釋液涂布于無菌培養(yǎng)皿中，倒置于30～37 ℃溫箱內(nèi)，使之干燥以便于單菌落的出現(xiàn)。取單菌落，在上述無冷凝水的平板一側(cè)邊緣處，涂抹在直徑約為1 cm大小的面積上；反復(fù)操作以劃滿整個平板為宜，倒置平板，于30 ℃培養(yǎng)1～2 d，出現(xiàn)單菌落。觀察其菌落形態(tài)，記錄包括形狀、大小、表面、隆起形狀、菌落及培養(yǎng)基的顏色等指標(biāo)。

1.3.2 醋酸菌理化鑒定

將菌株CS-63在YPG培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，對菌株進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、乙醇氧化試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)及葡萄糖氧化試驗(yàn)，具體操作方法參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9-10]。

產(chǎn)酸定性試驗(yàn)：檢測方法參照李素燕的測定方法[11]。

1.3.3 醋酸菌的16S rRNA鑒定

1.3.3.1 醋酸菌基因組DNA的提取

采用天根生化細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取單個菌株的基因組DNA。提取的基因組DNA可用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和濃度。

1.3.3.2 醋酸菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增16S rRNA基因引物為細(xì)菌通用引物FA-27F(5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)與RA-1495R(5′-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)。

16S rRNA基因的PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，1 min；退火58 ℃，1 min；延伸72 ℃，2 min；循環(huán)30次，末端延伸72 ℃，10 min；4 ℃保溫。

1.3.3.3 16S rRNA PCR產(chǎn)物測序分析

擴(kuò)增結(jié)束后，取約5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加1 μL 6×Loading Buffer，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，電壓5 V/cm，電泳液為1×TAE。如果擴(kuò)增條帶在1500 bp處清晰并且沒有拖尾、彌散現(xiàn)象，說明PCR擴(kuò)增成功。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司成都測序部進(jìn)行雙向測序。

1.3.3.4 16S rRNA基因同源性比對

使用DNA Star 5.01 軟件中的SeqMan模塊對測序得到的兩條16S rRNA基因序列進(jìn)行整理、拼接、校準(zhǔn)，得到1450 bp左右的有效序列。然后將拼接后的序列運(yùn)用NCBI(National Center for Biotechnology Information)中的同源性比對工具BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)將所得測序結(jié)果與GenBank上已知地位的醋酸菌株進(jìn)行對比，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定待測菌株種屬。

1.3.3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將與菌株CS-63對應(yīng)的16S rRNA基因序列從GenBank中下載下來，然后運(yùn)用Clustal W多重比對得到菌株間的同源性相似百分比。再使用MEGA 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過鄰接法(Neighbor-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并進(jìn)行1000次重復(fù)的Boot-straps統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

1.3.4 醋酸菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.4.1 不同培養(yǎng)基對菌株產(chǎn)酸量的影響

配制好培養(yǎng)基，在121 ℃下滅菌15 min，冷卻后將菌株分別接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和YPG培養(yǎng)基中，于30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d，取2 mL發(fā)酵液，測定產(chǎn)酸量，每組設(shè)置3個平行。

醋酸菌株產(chǎn)酸量的測定與計(jì)算：檢測方法參照李文等的測定方法[12]。

1.3.4.2 不同乙醇濃度對菌株產(chǎn)酸量的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌15 min，無菌條件下冷卻到室溫，向培養(yǎng)基中加入無水乙醇，使培養(yǎng)基乙醇的終濃度為 3%、4%、5%、6%、7%，將菌株CS-63分別接種于不同乙醇濃度的培養(yǎng)基中，每個乙醇濃度設(shè)定3組平行試驗(yàn)，在30 ℃下靜置培養(yǎng) 5 d，取2 mL發(fā)酵液，測定產(chǎn)酸量。

1.3.4.3 不同培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酸量的影響

設(shè)定培養(yǎng)溫度梯度分別為 4，25，30，37，41 ℃，其他條件不變，靜置培養(yǎng)5 d，每個溫度設(shè)定3組平行，取2 mL發(fā)酵液，測定產(chǎn)酸量。

1.3.4.4 不同pH對菌株產(chǎn)酸量的影響

用0.1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L HCl溶液將培養(yǎng)基的pH分別調(diào)成3，4.5，5.5，6.5，7.5，其他條件不變,在30 ℃條件下靜置培養(yǎng)5 d，取2 mL發(fā)酵液，測定產(chǎn)酸量，每個pH設(shè)置3組平行。

1.3.4.5 正交試驗(yàn)分析表

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)基、pH、溫度和乙醇濃度設(shè)為試驗(yàn)因素，利用L9(34)正交試驗(yàn)，根據(jù)菌株產(chǎn)酸量的多少，分析各因素對醋酸產(chǎn)量的影響，優(yōu)化菌株CS-63的培養(yǎng)條件。正交試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 菌珠的鑒定

2.1.1 理化鑒定

菌株CS-63的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 醋酸菌理化鑒定結(jié)果Table 2 The physicochemical identification results of Acetobacter

由表2可知，菌株CS-63革蘭氏染色為陰性，能夠產(chǎn)酸，能夠利用乙醇；氧化酶、接觸酶和葡萄糖氧化試驗(yàn)為陽性，不能使淀粉水解，由此初步鑒定結(jié)果可以判定其為醋酸桿菌屬。

2.1.2 16S rRNA鑒定

2.1.2.1 菌種DNA提取及16S rRNA擴(kuò)增結(jié)果

DNA濃度和OD260/280的測定：純DNA樣品的OD260/280值在1.8～2.0之間。經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測見圖1。

圖1 PCR反應(yīng)結(jié)果圖Fig.1 PCR reaction results

由圖1可知，疑似醋酸菌菌株的PCR擴(kuò)增后在大約1500 bp處有一條清晰明亮的條帶，并且沒有彌散現(xiàn)象和明顯非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，說明菌株的16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物可以滿足測序的要求。

2.1.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析

為了鑒定待測菌株，通過BLAST在NCBI中分析所有待測菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列，以與模式菌株序列同源性大于99%為種的鑒定閾值，通過MEGA 5.2構(gòu)建醋酸菌模式株和分離株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究和系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖2和圖3。

圖2 菌株CS-63同源性分析Fig.2 Homology analysis of CS-63 strain

圖3 菌株CS-63系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of CS-63 strain

通過序列對比、系統(tǒng)發(fā)育樹及同源性分析發(fā)現(xiàn)，菌株CS-63與模式菌株Acetobactersyzygii(HM217935.1/HM218259.1)聚為一類，且同源性達(dá)到99.9%，與它們親緣關(guān)系最近，因此可以將菌株CS-63歸為蒲桃醋酸桿菌(Acetobactersyzygii)。

2.2 醋酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 不同培養(yǎng)基對菌株產(chǎn)酸量的影響

圖4 不同培養(yǎng)基對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effects of different culture media on the acid yield of the strain

由圖4可知，YPG培養(yǎng)基中產(chǎn)量最低，為0.45 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中都含有酵母浸提物和葡萄糖兩種共同成分，且比例相同，但發(fā)酵培養(yǎng)基中含有蛋白胨，而基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不含有，由此可推測發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨對該菌株的產(chǎn)酸可能具有促進(jìn)作用；YPG培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基含有共同的成分：酵母浸提物、葡萄糖和蛋白胨，但這3種營養(yǎng)物質(zhì)的比例不同，在發(fā)酵培養(yǎng)基中這3種物質(zhì)的比例是10∶10∶3，在YPG培養(yǎng)基中的比例是5∶3∶2，由此可推測培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的比例不同也可能影響菌株CS-63的產(chǎn)酸特性。

2.2.2 不同乙醇濃度對產(chǎn)酸量的影響

圖5 不同乙醇濃度對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.5 Effects of different ethanol concentrations on the acid yield of the strain

由圖5可知，隨著乙醇濃度的增大，菌株CS-63的產(chǎn)酸量呈先上升后下降的趨勢。菌株在乙醇體積分?jǐn)?shù)為起始濃度3%時，醋酸菌產(chǎn)酸量為3.45 g/L；當(dāng)乙醇濃度增大到4%時，菌株產(chǎn)酸量達(dá)到峰值，為4.65 g/L；當(dāng)培養(yǎng)基的乙醇濃度達(dá)到5%后菌株產(chǎn)酸量開始下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到6%時產(chǎn)酸量下降明顯，這可能是由于酒精有抑制細(xì)菌生長的作用，無水乙醇含量過高會抑制醋酸菌的繁殖代謝，導(dǎo)致菌株CS-63產(chǎn)酸量下降，因此菌株CS-63產(chǎn)酸的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%。譚才鄧等[13]、孫萬里[14]對腐爛水果中醋酸菌的產(chǎn)酸量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙醇濃度為4%時菌株產(chǎn)酸量最大，與本研究結(jié)論一致；李華敏等[15]對蘋果醋中醋酸菌的產(chǎn)酸量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)酸的最佳乙醇濃度為6%，與本研究的結(jié)論有所出入，這可能是由于不同的菌株生長有不同的營養(yǎng)需求。

2.2.3 不同培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酸量的影響

圖6 不同培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.6 Effects of different culture temperatures on the acid yield of the strain

由圖6可知，菌株CS-63的產(chǎn)酸量隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。該菌株在4 ℃時幾乎不產(chǎn)酸，這可能是由于在該溫度下，醋酸菌幾乎不能生長；在30 ℃時產(chǎn)酸量達(dá)到峰值，為2.48 g/L；當(dāng)溫度超過30 ℃，產(chǎn)酸量出現(xiàn)下降趨勢；當(dāng)溫度升高到41 ℃時，產(chǎn)酸量只有0.75 g/L，這可能是由于過高的溫度抑制了醋酸菌的生長，且高溫也會對酶的活性產(chǎn)生影響，因此可得知該菌株產(chǎn)酸的最佳溫度是30 ℃。武斌等[16]研究了巴氏醋桿菌在不同溫度下的產(chǎn)酸特性，結(jié)果表明30 ℃是該菌株的最適培養(yǎng)溫度；盧夢瑤等[17]研究了酵素中醋酸菌對不同溫度的適應(yīng)性，結(jié)果表明在30 ℃時產(chǎn)酸量最高，均與本研究結(jié)論相一致。

2.2.4 不同pH值對產(chǎn)酸量的影響

圖7 不同pH對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.7 Effects of different pH values on the acid yield of the strain

由圖7可知，菌株CS-63的產(chǎn)酸量隨著pH的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，pH為3時產(chǎn)酸量最少，為2.55 g/L；當(dāng)pH升高到5.5時，產(chǎn)酸量達(dá)到峰值，為18.45 g/L；當(dāng)pH達(dá)到6.5后，產(chǎn)酸量急劇下降，當(dāng)pH繼續(xù)升高達(dá)到7.5時，產(chǎn)酸量只有7.95 g/L。該菌株在pH過高或過低時產(chǎn)酸量均很低，說明該菌株在過酸、過堿環(huán)境下不宜生長繁殖和代謝，且機(jī)體中的大多數(shù)反應(yīng)與酶有關(guān)，過酸、過堿都會導(dǎo)致酶活力降低，從而導(dǎo)致產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量下降，由此可知菌株CS-63產(chǎn)酸的最佳pH為5.5．劉曉棟等[18]研究了醋酸菌As1.41在不同pH條件下的最高產(chǎn)酸量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH為5.5時菌株產(chǎn)酸量達(dá)到最大，均與本研究結(jié)論相一致。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表3 以醋酸菌產(chǎn)量為檢測指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 3 The orthogonal test results with acetic bacteria yield as the detection index

由表3可知，各因素影響菌株CS-63產(chǎn)酸的主次順序?yàn)閜H>乙醇濃度>培養(yǎng)基>培養(yǎng)溫度，得出最佳工藝條件為A3B1C1D3。由正交表得到的最佳工藝參數(shù)為A3B1C1D3，與試驗(yàn)中產(chǎn)酸量最高的第7組A3B1C2D3不相符，因此需要驗(yàn)證試驗(yàn)A3B1C1D3和A3B1C2D3。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果：組合A3B1C1D3的產(chǎn)酸量為15.4 g/L，組合A3B1C2D3的產(chǎn)酸量為14.7 g/L，即A3B1C1D3組優(yōu)于A3B1C2D3組。因此可得醋酸菌CS-63的最佳產(chǎn)酸條件為：25 ℃下在乙醇濃度為5%，pH 4.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

3 結(jié)論

本研究以菌株CS-63為對象，采用生理生化特征與16S rRNA保守序列分析相結(jié)合的方法對其進(jìn)行鑒定，最終確定其為蒲桃醋酸桿菌(Acetobactersyzygii)；對該菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，分別研究了菌株CS-63在不同培養(yǎng)基、乙醇濃度、培養(yǎng)溫度和pH下的產(chǎn)酸量，并以不同培養(yǎng)基、乙醇濃度、培養(yǎng)溫度和pH為試驗(yàn)因素進(jìn)行正交分析，最終得出該菌株的最佳產(chǎn)酸培養(yǎng)條件為：25 ℃下在乙醇濃度為5%，pH 4.5的發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，酵母提取物1%)中培養(yǎng)。

目前對蒲桃醋酸桿菌的研究鮮少，本文對該菌株的鑒定及最適產(chǎn)酸條件的研究，可為后續(xù)該菌株在實(shí)際應(yīng)用中提供數(shù)據(jù)支撐，同時也為工藝上采用純菌發(fā)酵奠定基礎(chǔ)，但本研究只選取了4個影響因素來研究該菌株的產(chǎn)酸特性，具有一定局限性，為更好地將其應(yīng)用到實(shí)際生活中，日后還可對該菌株進(jìn)行更加全面的研究，探索其他影響因素對其生長繁殖和產(chǎn)酸的影響，比如接種量、不同碳源、初始乙酸濃度、礦化度等；或研究該菌株的酒精轉(zhuǎn)換率、遺傳穩(wěn)定性等；或經(jīng)誘變得到耐高溫、耐高乙醇、耐高乙酸的菌種。