孫亞云，蘇建華，張俊華，馬永賓，張尊勝，查全斌

腦缺血和再灌注損傷是缺血性腦卒中的病理機制，造成腦組織內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞損傷，影響大腦功能。一方面腦血流供應受阻能夠造成腦組織代謝的嚴重不平衡，引起腦組織損傷，更重要的是隨后的缺血再灌注將促進腦組織中自由基生成，常加劇腦缺血損傷[1]。腦缺血程度和持續(xù)時間及再灌注的時間影響腦缺血再灌注損傷的診治及預后[2]。研究表明，miR-211-5p在多種生物體的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[3]，在大鼠缺血再灌注模型中表達增加可以減輕缺血再灌注損傷[4]，但是具體機制仍不清楚。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)可以營養(yǎng)神經(jīng)細胞，減輕急性腦梗死患者缺血再灌注損傷。有研究表明，腦梗死早期梗死灶周圍BDNF呈高表達[5]。由此可見，BDNF由梗死灶周圍組織代償性生成以減輕梗死部位(尤其是缺血半暗帶區(qū))損傷。因此，探索miR-211-5p是否靶向BDNF以減輕大腦缺血再灌注損傷尤為重要。

1 材料與方法

1.1局灶性腦缺血再灌注(MCAO/R)大鼠模型的建立及分組 選用斯萊克公司SPF級成年大鼠40只，體質(zhì)量250～280 g。本研究符合相關(guān)管理準則及實驗動物倫理要求，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0002。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉。分離右側(cè)頸總動脈，做“V形”切口后插入尼龍栓線至大腦中動脈起始段(約18 mm，可見黑色標記至三岔口)，扎緊栓線90 min后拔出，建立MCAO/R大鼠模型，動物給藥均在造模前24 h行側(cè)腦室注射。動物隨機分為4組，每組10只。假手術(shù)組(Sham組)：拴線深度5 mm，其他手術(shù)過程同MCAO/R+溶劑組(Vehicle組)；Vehicle組：造模后注射5 μl 1%DMSO助溶劑；MCAO/R+miR-211-5p組(Mimic組)：造模前7 d，以0.1 μl/min顱內(nèi)立體定位注射miR-211-5p mimic片段溶液8 μl；MCAO/R+anti-miR-211-5p組(Antagomir組)：注射miR-211-5p Antagomir的方法同Mimic組。造模相關(guān)溶劑類藥物均來自美國Sigma公司。

1.2實驗方法 ①神經(jīng)功能缺損評分：采用Longa 5分法[6]評定大鼠神經(jīng)功能缺損情況。將大鼠放置在桌面上，正常運動記0分，左前肢伸展障礙記1分，行走轉(zhuǎn)圈記2分，行走傾斜記3分，行走障礙記4分；若大鼠在造模后死亡記5分。0～4分納入統(tǒng)計，5分在數(shù)據(jù)統(tǒng)計時剔除。 ②腦梗死體積測定：在再灌注72 h后，大鼠麻醉處死取出完整腦組織，-20 ℃速凍30～60 min后，冰上均勻切片。配置1%TTC染液，37 ℃恒溫避光孵育腦切片15 min，觀察腦組織變化。腦梗死體積百分比采用Image J軟件計算。③BDNF與miR-211-5p檢測：取-80 ℃冰箱保存的大鼠腦皮質(zhì)及海馬組織，組織勻漿后以10 000×g 4 ℃離心15 min，收集上清。采用Q-PCR檢測血清miR-211-5p含量，采用ELISA和Western blot法測定BDNF表達。按照ELISA試劑盒說明書，將含有BDNF的血清標本、標準品、稀釋的檢測抗體(已被辣根過氧化物酶標記)加入到預先被人BDNF捕獲抗體包裹的標板孔中，經(jīng)過孵育及洗滌，再用底物溶液三甲基六亞甲基二胺顯色，催化后采用酶標儀測定450 nm波長下的光密度(OD)值，并根據(jù)OD值得出所對應血清的BDNF濃度值。

2 結(jié)果

2.1腦梗死大鼠存活率及神經(jīng)功能缺損評分 Sham組、Vehicle組、Mimic組、Antagomir組大鼠存活率分別為100.00%、50.00%、80.00%、60.00%。Vehicle組存活率較Sham組顯著降低，miR-211-5p處理后較Vehicle組顯著升高，拮抗miR-211-5p后存活率降低(P<0.05)。對各組大鼠進行Longa評分，Vehicle組較Sham組評分明顯升高，應用miR-211-5p后評分降低，拮抗miR-211-5p后評分升高(P<0.05)。見圖1。

2.2大腦梗死體積評估 隨機選取各組4只大鼠完整腦組織行TTC染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Vehicle組比較，Mimic組腦梗死體積百分比明顯降低，應用anti-miR-211-5p后，Antagomir組腦梗死體積百分比高于Mimic組(P<0.05)。見圖2。

圖1 4組MCAO/R大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

圖2 4組MCAO/R大鼠腦梗死體積比較

2.3miR-211-5p表達結(jié)果比較 與Sham組和Vehicle組比較，Mimic組miR-211-5p表達量升高，Antagomir組表達量降低，Antagomir組miR-211-5p表達量低于Mimic組(P<0.05)。見圖3。

圖3 4組MCAO/R大鼠miR-211-5p表達水平比較

2.4ELISA法檢測BDNF蛋白表達 Mimic組BDNF表達量高于其他3組，Vehicle組和Antagomir組低于Sham組，Antagomir組低于Vehicle組(P<0.05)。見圖4。

圖4 ELISA法檢測4組MCAO/R大鼠BDNF蛋白表達水平比較

2.5Western blot法檢測BDNF蛋白表達 Mimic組BDNF表達量高于其他3組，Vehicle組和Antagomir組低于Sham組，Antagomir組低于Vehicle組(P<0.05)。見圖5。

圖5 Western blot法檢測4組MCAO/R大鼠BDNF蛋白表達水平比較

3 討論

miRNA可調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞內(nèi)多種靶基因，對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有重要作用[7]。有研究表明miRNA調(diào)控眾多炎性介質(zhì)的細胞內(nèi)通路[8]。miR-211-5p在多種腫瘤、精神疾病和心腦血管疾病中發(fā)揮重要作用[9]。盡管有新的證據(jù)表明miRNA在人類和嚙齒類動物腦卒中后均會發(fā)生改變，但是關(guān)于miR-211-5p在腦卒中后炎癥反應調(diào)節(jié)中的作用及機制研究仍然有限。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a可以抑制少突膠質(zhì)前體細胞(OPC)中IPAK-1，增加髓磷脂蛋白并降低OPC的凋亡，從而改善腦缺血再灌注損傷[10]；miR-3473b通過靶向小鼠小膠質(zhì)細胞BV2細胞株的細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子3來降低小鼠的適應性免疫調(diào)節(jié)[11]；抑制miR-19a可以調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和神經(jīng)細胞凋亡來保護缺血性損傷的神經(jīng)細胞[12]；Mcl-1是Bcl-2家族成員，miR-106b-5p抑制劑可以增強抗神經(jīng)細胞凋亡效應，從而修復腦缺血再灌注損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠側(cè)腦室注射miR-211-5p后，存活率升高而Longa評分降低，大鼠腦梗死體積百分比降低，說明miR-211-5p具有修復大鼠MCAO/R損傷的作用。

miR-211-5p在多種生物體的病理生理過程具有重要的調(diào)控作用[14]，通過下調(diào)膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)表達進而抑制骨髓間充質(zhì)干細胞向腸神經(jīng)節(jié)細胞分化[15]；miR-211/BDNF軸通過PI3K/AKT途徑調(diào)節(jié)脂多糖誘導的星形膠質(zhì)細胞增殖，提示其可能成為脊髓灰質(zhì)損傷后反應性星形膠質(zhì)細胞增殖干預策略的靶點[16]；在新生大鼠MCAO/R模型中，miR-211/GDNF減少Neuro2A細胞凋亡，從而減輕缺氧缺血性損傷[17]。有研究認為，miR-211-5p在缺血性腦病中起重要作用，在大鼠缺血再灌注模型中表達增加并可減輕大鼠缺血再灌注損傷[4]。進一步檢測BDNF表達水平發(fā)現(xiàn)，BDNF在Mimic組中表達量高于Sham組，Antagomir組表達量最低，說明BDNF能減輕MCAO/R大鼠神經(jīng)功能損傷，提高生存率；推測BDNF表達變化與miR-211-5p存在一定關(guān)系，miR-211-5p通過靶向調(diào)控BDNF參與對MCAO/R大鼠的腦損傷保護。

綜上，miR-211-5p表達水平與大鼠MCAO/R損傷具有相關(guān)性。