王振位， 聶黎虹， 楊博雅， 劉子洋， 甄 旭， 趙瑞寧

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院泌尿外科，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 3.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性好發(fā)惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率與病死率分別位居男性惡性腫瘤的第2 位和第5 位，嚴(yán)重危害中老年男性健康[1]。PCa 進(jìn)展的主要方式由雄激素受體（androgen receptor，AR）信號通路介導(dǎo)，因此干擾該信號通路的功能一直是治療晚期PCa 的重要措施之一，如雄激素剝奪治療、AR 阻斷治療等[2]。上述治療措施僅在初期具有顯著療效，一般3 年左右演變成去勢抵抗性前列腺癌（castrate-resistant prostate cancer，CRPC），其患者預(yù)后更差、病死率更高[3]。而靶向抑制AR 信號通路的功能依然是CRPC 的重要治療措施。雄激素在體內(nèi)作為AR 的主要配體，一直被認(rèn)為是促進(jìn)PCa 進(jìn)展的主要原因[4]。但有臨床實(shí)驗(yàn)研究[5]發(fā)現(xiàn)，PCa 患者根治術(shù)后給予雄激素治療，維持血清睪酮水平在300～375 ng·mL-1，患者腫瘤復(fù)發(fā)率降低、中位生存期延長。另有研究[6-7]表明，AR信號通路對PCa 的發(fā)展具有抑制和促增殖的雙向作用。目前，關(guān)于雄激素是否可通過調(diào)節(jié)AR信號通路抑制CRPC 階段PCa 細(xì)胞增殖的研究鮮有報(bào)道。本研究采用雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）對C4-2B 細(xì)胞進(jìn)行處理，探討DHT對C4-2B 細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能機(jī)制，給CRPC 的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

C4-2B 細(xì)胞由美國加州大學(xué)Davis 分校的AllenC.Gao 教授惠贈；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購于ThermoFisher 公司；DHT 以及渥曼青霉素（wortmannin，WM）購于APExBio 公司；胰蛋白酶、青/鏈霉素混合液（P/S）、無酚紅1640 培養(yǎng)基、一抗稀釋液購于北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（FBS）以及磷酸緩沖鹽溶液（PBS）購于Gibco 公司；AnnexinVFITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白含量檢測試劑盒、New-SUPERECL 檢測試劑盒購于江蘇凱基生物科技公司；B 淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)蛋白X（BAX）、裂解型胱天蛋白酶3（cleaved-caspase3，c-caspase3）、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、AR 兔抗人多克隆抗體購于ProteinTech 公司；AR 剪接變異體-7（androgen receptor splicevariant-7，AR-V7）兔抗人多克隆抗體購于Cell Signaling Technology 公司；β-Actin小鼠抗人多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG 購于北京中杉金橋公司；CCK-8 試劑盒購于賽文創(chuàng)新（北京）科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 C4-2B 細(xì)胞培養(yǎng) C4-2B 細(xì)胞在完全培養(yǎng)基（90%無酚紅1640 培養(yǎng)基，10%FBS，1%P/S）、恒溫37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 更換1 次培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁生長至80%左右傳代。

1.2.2 CCK-8 法檢測C4-2B 細(xì)胞增殖活性 取對數(shù)生長期的C4-2B 細(xì)胞，用含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶進(jìn)行消化，細(xì)胞脫落變圓后，加入完全培養(yǎng)基終止消化過程，1 000 r·min-1離心5 min；棄去上清液，同時(shí)加入完全培養(yǎng)基、重懸細(xì)胞，以5 000 個(gè)/100 μL 將細(xì)胞接種至96 孔板。設(shè)置空白組、對照組（0 ng·mL-1DHT）和DHT 濃度梯度組0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 ng·mL-1，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔；CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞完全貼壁后，各組予以相應(yīng)處理，記為第1 天，48 h 更換含有不同濃度DHT 的完全培養(yǎng)基1 次，于第10 天終止培養(yǎng)。以換液的形式各孔加入含10%CCK-8 試劑的完全培養(yǎng)基，37 ℃條件孵育1 h，設(shè)置酶標(biāo)儀450 nm 波長，檢測各孔吸光度A 值并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞存活率=［（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對照組-A空白組）］×100%。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期C4-2B細(xì)胞，接種于6 孔板，使每孔細(xì)胞為1.5×104個(gè)，24 h 細(xì)胞貼壁后，予DHT 干預(yù)。設(shè)置對照組（0 ng·mL-1）、DHT 處理組（0.25、0.5 ng·mL-1）；48 h 更換含相應(yīng)濃度DHT 的培養(yǎng)基，于第7 天在倒置相差顯微鏡（×100）下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測DHT 對C4-2B 細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的C4-2B 細(xì)胞，用6 孔板接種細(xì)胞，密度為800 個(gè)/孔。孵育24 h待細(xì)胞貼壁后，加入0、0.25、0.5 ng·mL-1DHT 處理，于培養(yǎng)箱中孵育，7 d 更換1 次含相應(yīng)濃度DHT 的培養(yǎng)基，干預(yù)第14 天終止實(shí)驗(yàn)。PBS 漂洗2 次，預(yù)冷甲醇固定20 min；棄甲醇，每孔加入1 mL 結(jié)晶紫溶液（0.1%）染色處理0.5 h，PBS 再次漂洗2 次，空氣干燥。拍照并記錄肉眼可見克隆形成數(shù)目，計(jì)算克隆形成率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用Image J 進(jìn)行處理?？寺⌒纬陕?（克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測C4-2B 細(xì)胞的凋亡 收集對數(shù)期C4-2B 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度并均勻接種于30 mm 培養(yǎng)皿中，使各皿細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)。給予0、0.25、0.5 ng·mL-1DHT 刺激，每48 h 換液1 次，于第5 天終止。收集細(xì)胞于1.5 mL 的EP管中。4 ℃、300×g 離心5 min，棄上清液，冷PBS清洗2 遍，每管加400 μL 的1×AnnexinV-FITC 結(jié)合液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL。先后加入8 μL的AnnexinV-FITC 染液避光孵育15 min、5 μL 的PI 染液避光孵育5 min，孵育溫度4 ℃。凋亡率使用流式細(xì)胞儀檢測，數(shù)據(jù)用FlowJo 進(jìn)行處理。

1.2.6 Western blot 檢測C4-2B 細(xì)胞AR、ARV7、Bcl-2、BAX、c-caspase3、p-PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá) C4-2B 細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)收集并接種于60 mm 培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁生長到50%～60%時(shí)，分別加入0、0.25、0.5 ng·mL-1DHT進(jìn)行處理，設(shè)0 ng·mL-1DHT 為對照組，檢測相關(guān)蛋白表達(dá)情況。抑制劑選用磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylin ositol-3-kinase，PI3K）特異性抑制劑WM 干預(yù)，檢測該通路的效應(yīng)[8]。設(shè)0 ng·mL-1對照組、0.5 ng·mL-1DHT 處理組、3 μmol·mL-1WM 處理組、0.5 ng·mL-1DHT 和3 μmol·mL-1WM 聯(lián)合處理組，刺激72 h。收集細(xì)胞，用含有蛋白酶、磷酸酶抑制劑的裂解液，冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白，蛋白總量以具氰基丙烯酸正丁酯（BCA）法確定，以總體積的50%比例加入5 倍濃度蛋白上樣緩沖液充分混勻，金屬浴鍋處理100 ℃8 min 后，變性蛋白儲存于-20 ℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以10%的SDS-PAGE 凝膠120 V 電泳條件分離蛋白，320 mA 恒流1 h 將不同分子質(zhì)量蛋白轉(zhuǎn)至0.45 μm 或0.22 μm 的PVDF 膜上；封閉液（5%脫脂奶粉）常溫下封閉膜2 h，PBST 洗膜1 次，8 min；內(nèi)參選擇β-Actin（1∶2 000），分別加BAX（1∶10 000）、Bcl-2（1∶3 000）、c-caspase3（1∶1 000）、AR（1∶2 000）、AR-V7（1∶1 000）、p-PI3K（1∶2 000）、p-AKT（1∶2 000）、β-Actin 一抗孵育2 h，PBST 洗膜3 次，每次10 min；二抗（1∶5 000）孵育1 h，PBST 洗膜3 次，每次12 min；ECL 發(fā)光液制備，使用熒光圖像分析儀曝光拍照。曝光后用Image J 進(jìn)行條帶灰度值檢測，對目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白β-Actin 灰度值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間對比采用單因素方差分析（ANOVA）；以百分比（%）描述計(jì)數(shù)資料。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHT 抑制C4-2B 細(xì)胞增殖

細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示，不同濃度DHT 處理C4-2B 細(xì)胞后，0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 ng·mL-1組存活率分別為（0.686±0.05）%、（0.590±0.06）%、（0.43±0.03）%、（0.415±0.03）%、（0.331±0.04）%、（0.218±0.03）%、（0.202±0.01）%、（0.193±0.01）%、（0.194±0.01）%，與對照組（0 ng·mL-1DHT）相比，DHT 濃度呈梯度增加時(shí)，各組C4-2B細(xì)胞的存活率均降低（P 均＜0.01）。在0.125、0.25、0.5 ng·mL-1各組［生理劑量范圍（0.11～0.96 ng·mL-1）］間細(xì)胞存活率比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均<0.01）；在1、2、4 ng·mL-1各組［超生理劑量范圍（>0.96 ng·mL-1）］間細(xì)胞存活率差異也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均<0.05），而4、8、16 及32 ng·mL-1DHT 處理組間細(xì)胞存活率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均>0.05），見圖1。

圖1 不同濃度DHT 對C4-2B 細(xì)胞存活率的影響

2.2 DHT 對C4-2B 細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)的影響

選用0、0.25、0.5 ng·mL-1劑量DHT 處理C4-2B 細(xì)胞7 d。對照組（0 ng·mL-1DHT）C4-2B細(xì)胞生長狀態(tài)好，呈梭形，細(xì)胞間相互接觸，不易脫落，基本無漂浮細(xì)胞；0.25、0.5 ng·mL-1DHT 處理細(xì)胞后，可見貼壁細(xì)胞體積縮小、變圓，周圍可見大量細(xì)胞碎片，細(xì)胞形狀呈不規(guī)則改變，細(xì)胞貼壁能力減弱，易脫落，可見大量漂浮死細(xì)胞，整體細(xì)胞密度較對照組明顯減少，見圖2。

圖2 不同濃度DHT 對C4-2B 細(xì)胞形態(tài)的影響（相差顯微鏡×100）

2.3 DHT 抑制C4-2B 細(xì)胞克隆形成能力

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.25、0.5 ng·mL-1DHT 處理組細(xì)胞克隆形成率分別為（16.67±1.7）%、（12.5±0.9）%，與對照組（0 ng·mL-1DHT）克隆形成率（22.7±1.9）%相比，克隆形成率均減少（P 均＜0.01），所形成的克隆體積較小、染色變淺，見圖3。

圖3 DHT 對C4-2B 細(xì)胞克隆形成能力的影響

2.4 DHT 增加C4-2B 細(xì)胞的凋亡率

流式細(xì)胞術(shù)測定凋亡結(jié)果顯示，0.25 ng·mL-1DHT 組凋亡率［（9.83±0.70）%］低于0.5 ng·mL-1DHT 組凋亡率［（13.1±0.4）%］（P＜0.01），且0.25、0.5 ng·mL-1DHT 凋亡率均高于對照組（0 ng·mL-1DHT）［（7.19±0.80）%］（P 均＜0.01），見圖4。

圖4 DHT 對C4-2B 細(xì)胞凋亡的影響

2.5 DHT 對C4-2B 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白BAX、Bcl-2、c-caspase3 蛋白表達(dá)的影響

Western blot 檢測各組凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示，與對照組（0 ng·mL-1DHT）相比，C4-2B 細(xì)胞中0.25、0.5 ng·mL-1DHT 處理組Bcl-2 蛋白表達(dá)均下調(diào)（P 均＜0.05）；與對照組（0 ng·mL-1DHT）相比，0.25、0.5 ng·mL-1DHT 處理組BAX、c-caspase3 蛋白表達(dá)量均上調(diào)（P 均＜0.01），而0.25、0.5 ng·mL-1DHT 處理組BAX/Bcl-2 比值也增加（P均＜0.05），見圖5。

圖5 Western blot 檢測DHT 對C4-2B 細(xì)胞Bcl-2、BAX、c-caspase3 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6 DHT 對C4-2B 細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、AR、AR-V7 蛋白的表達(dá)的影響

Western blot 檢測DHT 處理C4-2B 細(xì)胞后對照組及各DHT 處理組p-PI3K、p-AKT、AR、AR-V7 蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與對照組（0 ng·mL-1DHT）相比，0.25、0.5 ng·mL-1DHT 處理組C4-2B細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、AR、AR-V7 的蛋白表達(dá)量均下調(diào)（P 均＜0.05），見圖6。

圖6 Western blot 檢測DHT 對C4-2B 細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、AR、AR-V7 蛋白表達(dá)的影響

2.7 DHT 通過抑制PI3K 信號通路抑制C4-2B細(xì)胞AR、AR-V7 蛋白表達(dá)，促細(xì)胞凋亡

Western blot 檢測PI3K/AKT 通路相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白BAX、Bcl-2、c-caspase3 以及AR、AR-V7 蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，單用DHT 或WM（3 μmol·L-1）處理C4-2B 細(xì)胞后，與對照組（0 ng·mL-1DHT）相比，BAX、c-caspase3 蛋白表達(dá)上調(diào)，同時(shí)Bcl-2、p-PI3K、p-AKT、AR、AR-V7 蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P 均＜0.05），并且0.25、0.5 ng·mL-1DHT 處理組BAX/Bcl-2 比值均增加（P 均＜0.05）。聯(lián)合應(yīng)用DHT（0.5 ng·mL-1）、WM（3 μmol·L-1）共同處理C4-2B 細(xì)胞，與單用DHT（0.5 ng·mL-1）或WM（3 μmol·L-1）組相比，上述蛋白趨勢性變化更加明顯（P＜0.01），見圖7。

圖7 DHT、wortmannin 單用或聯(lián)合作用對C4-2B 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白以及PI3K/AKT 通路蛋白表達(dá)的影響

3 討論

雄激素剝奪理念最早由Huggins 提出，至今仍是PCa 的主要治療方案[9]。但部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)，給予不同劑量雄激素干預(yù)也會抑制PCa 細(xì)胞的增殖。Song 等[10]用不同濃度的睪酮和DHT 處理PCa細(xì)胞10 d 或20 d，AR 陽性的LNCaP 和MDAPCA2b細(xì)胞在DHT 生理水平范圍內(nèi)（0.11～0.96 ng·mL-1，MayoClinic）即表現(xiàn)出明顯抑制效應(yīng)；而AR 陰性的DU145 與PC3 細(xì)胞未見明顯抑制效應(yīng)。轉(zhuǎn)染AR 于AR 陰性的PCa 細(xì)胞CWR22RV1 后，Isaacs等[11]觀察到生理水平的雄激素可促其發(fā)生凋亡，提示在雄激素抑制PCa的增殖過程中，AR 信號的表達(dá)發(fā)揮關(guān)鍵作用。一項(xiàng)體內(nèi)研究還發(fā)現(xiàn)，雄激素可抑制恩雜魯胺耐藥CRPC 移植瘤的增殖[12]。

C4-2B 細(xì)胞是由LNCaP 與骨基質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞MS 相互作用得到的惡性程度較高的雄激素非依賴性細(xì)胞，其對激素不敏感并具有骨轉(zhuǎn)移能力，可作為臨床難治性PCa 的模型使用[13]。首先，使用對AR 具有高活性的DHT 作為靶向藥物刺激C4-2B 細(xì)胞，濃度范圍參考Song[10]的實(shí)驗(yàn)。CCK-8 結(jié)果提示，隨著DHT 濃度增加，對C4-2B細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，在生理劑量內(nèi)，呈濃度依賴性，在超生理劑量范圍內(nèi)，濃度依賴性不顯著，即抑制作用存在一個(gè)平臺期，繼續(xù)增大DHT 濃度，抑制效應(yīng)未見明顯變化，這與Song 等[10]實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分一致。因在生理劑量范圍內(nèi)，DHT對C4-2B 有抑制作用，因此本研究選擇0.25 和0.5 ng·mL-1的DHT 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

顯微鏡下直接觀察發(fā)現(xiàn)，DHT 處理細(xì)胞7 d后細(xì)胞貼壁能力變差、形態(tài)不規(guī)則、數(shù)量減少，提示可能與細(xì)胞凋亡增強(qiáng)有關(guān)。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C4-2B 克隆形成率可因DHT 的干預(yù)而降低。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)提示DHT 處理可使細(xì)胞凋亡率增加，提示生理濃度DHT 即可通過增加細(xì)胞凋亡水平抑制C4-2B 增殖。這與Joly-Pharaboz等[14]用合成雄激素類似物（R1881）100 和0.5 nm的DHT 處理LNCaP 細(xì)胞的結(jié)果相符。

細(xì)胞凋亡是由Bcl-2 家族介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡過程，其中BAX、Bcl-2 以及活化的c-caspase3是參與此過程的重要蛋白，BAX/Bcl-2 是評估細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)[15-16]。Western blot 結(jié)果顯示，DHT 處理細(xì)胞后，c-caspase3 以及BAX 蛋白表達(dá)均上調(diào)，Bcl2 蛋白表達(dá)下調(diào)，BAX/Bcl2 比例增大；提示誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是DHT 抑制C4-2B細(xì)胞增殖的主要原因。

在PCa 的進(jìn)展中，由于第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物的缺失，其下游信號通路PI3K/AKT 反復(fù)激活，是PCa 進(jìn)展的重要誘因之一[17-18]。目前有研究[19]發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT 信號通路與AR 信號通路之間具有相關(guān)性。Liu 等[20]研究發(fā)現(xiàn)雄激素可通過PI3K/AKT 信號通路激活A(yù)R 誘導(dǎo)前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）的表達(dá)。本研究顯示，給予DHT 處理C4-2B 細(xì)胞可引起p-PI3K、p-AKT、AR 蛋白表達(dá)量減少，可能是其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要原因。給予PI3K特異性抑制劑WM 干預(yù)，p-PI3K、p-AKT、AR 表達(dá)量也減少，而細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平增加；DHT聯(lián)合WM 干預(yù)后，p-PI3K、p-AKT、AR 表達(dá)下調(diào)更加顯著，提示DHT 可能通過抑制PI3K/AKT/AR信號通路促進(jìn)C4-2B 細(xì)胞的凋亡，從而抑制其增殖。本研究還顯示，給予DHT、WM 聯(lián)合干預(yù)后，AR-V7 與AR 呈現(xiàn)同樣的變化趨勢。AR 是配體依賴型的類固醇受體，但在去勢條件下，其AR轉(zhuǎn)錄組可發(fā)生適應(yīng)性改變，致缺乏配體結(jié)構(gòu)域的AR剪接變異體轉(zhuǎn)錄增多，進(jìn)而促PCa 細(xì)胞的增殖，這是CRPC 發(fā)生的重要原因之一[21-22]。提示DHT還可能通過抑制PI3K/AKT/AR-V7 信號通路促C4-2B 細(xì)胞凋亡。

綜上所述，生理濃度DHT 可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制C4-2B 細(xì)胞增殖，這可能與PI3K/AKT信號通路被抑制進(jìn)而下調(diào)AR、AR-V7 有關(guān)；但AR、AR-V7 在此過程中的作用差異還有待進(jìn)一步明確。本研究有望為CRPC 階段的PCa 治療提供簡單而費(fèi)用低廉的治療措施線索。