楊博雅， 趙瑞寧， 王振位， 李佳鑫， 秦凱悅，郭鳳英， 勉昱琛， 聶黎虹

（1.寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院泌尿外科，銀川 750004）

前列腺癌是一種最常見的男性惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率位列男性惡性腫瘤第二位[1]。近年來我國前列腺癌發(fā)病率呈上升趨勢，已成為我國發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一[2]。多數(shù)前列腺癌患者確診時已發(fā)展至中晚期，經(jīng)雄激素剝奪治療（androgen deprivation therapy，ADT）18～36個月后，幾乎均會發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），其患者預后更差[3]。因此，靶向CRPC 尋找有效防治前列腺癌的藥物顯得尤為重要。

甘草甜素（glycyrrhizin，GLY）為從甘草根莖中提取的三萜類化合物，是一種安全無毒的天然產(chǎn)物，在抗癌、抗炎及抗病毒等方面具有廣泛的藥理作用[4]。但GLY 是否可抑制CRPC 階段的前列腺癌細胞及其機制目前鮮有報道。本研究采用不同濃度GLY 干預人前列腺癌C4-2B 細胞，探討其對C4-2B 細胞增殖與凋亡的影響及可能機制，以期為豐富CRPC 臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

實驗所用的人前列腺癌細胞株C4-2B 由US California 大學Davis 分校Allen C.Gao 教授惠贈。

1.2 試劑

GLY 購自東京化成工業(yè)株式會社；胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（FBS）、磷酸緩沖鹽溶液PBS、RPMI 1640 培養(yǎng)基購自Biological Industries 公司；CCK-8 試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒購自江蘇凱基生物科技公司；兔抗B 淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、兔抗Bcl-2 相關(guān)蛋白X（Bax）、兔抗裂解型胱天蛋白酶3（c-Caspase3）、兔抗磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、兔抗磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）、兔抗蛋白激酶B（AKT）、兔抗磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、兔抗雄激素受體（androgen receptor，AR）購自Proteintech 公司；鼠抗β 肌動蛋白（β-Actin）多克隆抗體、HRP 標記的山羊抗小鼠IgG、HRP標記的山羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋公司；渥漫霉素（WM）購于APExBio 公司；ECL 發(fā)光液購自北京賽文公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將人前列腺癌細胞株C4-2B用含10%FBS、1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.2 CCK-8 法檢測 細胞存活率將處于對數(shù)生長期的C4-2B 細胞（5 000 個/孔）接種于96 孔板中，待細胞長至70%時，分別給予6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 μmol·L-1GLY 藥物處理，刺激48 h。48 h 后，取出96 孔板避光于每孔加入CCK-8 試劑10 μL，37 ℃溫箱孵育1 h 后，用酶標儀在波長為450 nm 處測定吸光度值并記錄。細胞的存活率=（加藥組-空白組）/（對照組-空白組）×100%，生長抑制率=100%-細胞存活率。

1.3.3 集落形成實驗 將處于對數(shù)生長期的C4-2B 細胞消化后接種于6 孔板中（1 000 個/孔），待細胞貼壁后，分別給予不同濃度的GLY（0、50、100、200、400 μmol·L-1）。14 d 后，棄去培養(yǎng)基，然后用甲醇對細胞進行固定20 min，然后用0.5%結(jié)晶紫染色15 min。當它們不少于50 個細胞聚集時，可對其進行菌落計數(shù)。

1.3.4 前列腺癌細胞計數(shù) 觀察細胞的生長狀態(tài)，將處于對數(shù)生長期C4-2B 細胞鋪板并給予不同濃度的GLY（0、100、200、400 μmol·L-1）刺激，48 h后可以對培養(yǎng)的細胞進行計數(shù)。首先用胰酶對細胞進行消化，制備成單細胞懸液，離心后吸取上清再加入1 mL 新配置的完全培養(yǎng)基，用移液管反復吹打混勻，動作輕柔，最后使用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)。

1.3.5 流式細胞術(shù)檢測 將細胞種植于6 孔板，給予0、200、300、400 μmol·L-1GLY 刺激48 h。用不含乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶消化，收集細胞于1.5 mL EP 管中。400×g 離心5 min，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS 緩沖液清洗2 次，然后每管加入400 μL 的1×Annexin V-FITC 結(jié)合液調(diào)節(jié)細胞數(shù)為1×106個/mL。之后每管樣品中加入5 μL Annexin V-FITC 染色液混勻，4 ℃下避光孵育15 min，最后加入5 μL PI 染色液混勻后，4 ℃下避光孵育5 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.6 Western blot 實驗 待C42B 細胞生長至約70%，分別加入0、100、200、400 μmol·L-1GLY藥物處理48 h。48 h 后棄掉培養(yǎng)基，加入PBS 洗2 次，棄去PBS，加入胰蛋白酶消化2 min，鏡下觀察細胞漂浮且變圓后，加入完全培養(yǎng)基終止消化。在細胞懸液吹打混勻后，3 000 r·min-1離心5 min，棄上清；加1 mL PBS 吹打混勻后移入1.5 mL EP 管中，3 000 r·min-1離心5 min，棄上清得細胞。加入細胞裂解液裂解，置于冰上震蕩，12 000×g 離心5 min，用全蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，BCA法進行蛋白定量。配置10% SDS-PAGE 蛋白電泳凝膠，120 V 電泳結(jié)束后以260 mA 恒流轉(zhuǎn)膜1 h 轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，然后用5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h；PBST 洗膜3 次，每次10 min；再加入1∶2 000 稀釋的兔抗Bcl-2、1∶1 000 兔抗c-Caspase3、1∶2 000 兔抗PI3K、1∶2 000 兔抗AKT、1∶2 000 兔抗p-PI3K、1∶2 000 兔抗p-AKT、1∶5 000 稀釋的小鼠抗β-Actin、1∶5 000 兔抗Bax、1∶5 000 兔抗AR 室溫孵育2 h；孵育結(jié)束后，PBST 洗3 次，每次10 min；再加入1∶5 000 稀釋的HRP 標記的山羊抗小鼠IgG、HRP 標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，PBST 洗3 次，每次10 min；配置ECL 發(fā)光液后使用化學發(fā)光成像儀進行曝光拍照。使用Image J軟件做吸光度（A）值分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GLY 劑量依賴性抑制C4-2B 細胞增殖能力

與對照組（0 μmol·L-1GLY）相比，12.5、25、50、100、200、400、800 μmol·L-1GLY 組均可以抑制C4-2B 細胞的增殖（P＜0.05 或P＜0.01）；且隨著GLY 濃度增高，細胞增殖能力逐漸降低，組間對比細胞活性下降，呈劑量依賴性（P 均＜0.05）。GLY 作用于C4-2B 細胞48 h，測得其IC50為321.1 μmol·L-1，見圖1。

圖1 不同濃度GLY 對前列腺癌C4-2B 細胞抑制率的影響

2.2 GLY 對C4-2B 細胞數(shù)目及形態(tài)影響

經(jīng)顯微鏡觀察，對照組C4-2B 細胞狀態(tài)良好，貼壁生長。隨著GLY 濃度升高，細胞形態(tài)發(fā)生改變，由多觸角形變?yōu)閱斡|角及梭形，細胞變窄小、皺縮，培養(yǎng)液中懸浮顆粒增多，細胞碎片增多。同時，加藥組細胞數(shù)目與對照組比較（P 均＜0.01），組間100、200 和400 μmol·L-1GLY 組的C4-2B細胞數(shù)目呈劑量依賴性減少（P 均<0.01），見圖2。

圖2 GLY 對前列腺癌C4-2B 細胞形態(tài)及數(shù)目影響

2.3 GLY 劑量依賴性抑制C4-2B 細胞集落形成能力

與對照組（0 μmol·L-1GLY）相比，加藥組（100、200、400 μmol·L-1GLY）集落形成的數(shù)目均減少（P均＜0.01），100、200、400 μmol·L-1GLY 組間細胞克隆數(shù)目呈濃度依賴性減少（P 均<0.05），并且隨著濃度增加，形成集落較小，顏色變淺，見圖3。

圖3 GLY 對C4-2B 細胞集落形成能力的影響

2.4 GLY 對人前列腺癌細胞C4-2B 凋亡的影響

與對照組（0 μmol·L-1GLY）相比，GLY 處理組（100、200、400 μmol·L-1）凋亡率均增加（P 均＜0.05），組間比較凋亡率呈濃度依賴性增加（P 均<0.05），見圖4。

圖4 GLY 對人前列腺癌C4-2B 細胞凋亡的影響

2.5 GLY 對C4-2B 細胞Bax、Bcl-2、c-Caspase3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、AR 蛋白表達的影響

Western blot 實驗結(jié)果顯示，與對照組（0 μmol·L-1GLY）相比，GLY 處理組（200、400 μmol·L-1）Bcl-2 表達降低，Bax 表達升高，Bax/Bcl-2 表達升高（P 均＜0.05），GLY 處理組（100、200、400 μmol·L-1）c-Caspase3 表達均升高（P 均＜0.05），見圖5。Western blot 實驗檢測通路相關(guān)蛋白結(jié)果顯示，PI3K、AKT 蛋白表達無變化（P＞0.05）。與對照組（0 μmol·L-1GLY）相比，GLY 處理組（200、400 μmol·L-1）p-PI3K、p-AKT、AR 蛋白表達隨GLY濃度升高而降低（P 均＜0.01）。在加入PI3K抑制劑后，與對照組（0 μmol·L-1GLY）相比，p-PI3K、p-AKT、AR、Bcl-2 表達降低，Bax、c-Caspase3表達升高，Bax/Bcl-2 比值升高（P 均＜0.05），GLY 和WM 聯(lián)用組下降更明顯（P 均＜0.01），見圖6。

圖5 GLY 對C4-2B 細胞Bax、Bcl-2、c-Caspase3 蛋白表達的影響

圖6 GLY 對C4-2B 細胞PI3K 信號通路相關(guān)蛋白的影響

3 討論

CRPC 是前列腺癌患者治療發(fā)展的重要階段之一，其耐藥性產(chǎn)生的機制是前列腺癌治療研究的熱點問題。CRPC 的發(fā)生機制包括PI3K、WNT等激酶信號通路的異常激活、腫瘤免疫、腫瘤干細胞驅(qū)動、AR 及其變異體的過表達、上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化紊亂、DNA 修復障礙等，近年來AR 信號通路的調(diào)控機制受到越來越多的關(guān)注[5-6]。因此，靶向抑制AR 篩選防治CRPC 的藥物具有重要臨床意義。GLY 是一種從甘草根中提取的天然無毒化合物，具有抗腫瘤、抗炎及抗病毒等多種活性作用，研究表明，GLY 可通過PI3K/AKT 信號通路、調(diào)控細胞周期、相關(guān)蛋白抑制前列腺癌細胞增殖[7]。目前鮮有關(guān)于GLY 通過影響AR 抑制CRPC 細胞增殖的研究。

本研究選用前列腺癌細胞C4-2B，為雄激素非依賴型細胞，其經(jīng)歷了由雄激素依賴細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾嚰毎M了前列腺癌轉(zhuǎn)變?yōu)镃RPC 的過程，且高表達AR。首先，CCK-8 實驗結(jié)果顯示GLY 劑量依賴性抑制C4-2B 細胞活性、抑制率IC50為321.1 μmol·L-1，本研究選擇100、200、400 μmol·L-1作為后續(xù)實驗給藥濃度。隨著GLY 濃度增高，C4-2B 細胞數(shù)目減少，細胞變小、皺縮，由多觸角形變?yōu)樗笮危斯炭s破碎，細胞碎片增多。細胞克隆實驗顯示，隨GLY 濃度增大，集落形成數(shù)目減少，單個集落體積變小，顏色變淺。提示細胞可能發(fā)生凋亡，進一步流式細胞儀檢測結(jié)果提示GLY 促進前列腺癌C4-2B 細胞凋亡呈劑量依賴性增加。以上結(jié)果與Wang 等[8]結(jié)果相符。綜上提示，GLY 可以抑制前列腺癌C4-2B 細胞增殖、可能促其凋亡。

細胞凋亡，是一種由基因控制的細胞自主性死亡方式[9]。由Bcl-2 家族介導，存在兩種形式，促凋亡蛋白，如Bax、Bad 等，抑凋亡蛋白，如Bcl-2等，常以Bax 與Bcl-2 因子的相對比值作為凋亡指數(shù)來衡量細胞進入凋亡的狀態(tài)，比值增加，從而激活下游Caspase3，促其活化為c-Caspase3，使細胞進入不可逆凋亡階段的標志[10]。為了進一步明確GLY 促C4-2B 細胞凋亡的現(xiàn)象，我們檢測了Bcl-2、Bax、c-Caspase3 蛋白表達變化。GLY（200、400 μmol·L-1）均可使C4-2B 細胞Bcl-2 蛋白表達降低，Bax、c-Caspase3 蛋白表達升高，Bax/Bcl-2 比值升高；進一步證實了GLY 可促C4-2B細胞凋亡，這與Orazizadeh 等[11]GLY 對凋亡蛋白作用結(jié)果相一致。

在大約40%的前列腺癌和70%的轉(zhuǎn)移性前列腺癌中發(fā)現(xiàn)了PI3K/AKT 生存信號通路的突變，PTEN 是一種特異性的前列腺癌抑癌基因，它的缺失導致PI3K 的積聚，PI3K 激活AKT，抑制凋亡[12-13]。Kahn 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，通過激活PI3K/AKT信號通路，誘導AR 磷酸化，可促進前列腺癌細胞生長，抑制凋亡。提示PI3K/AKT 與AR 信號通路的相互作用在前列腺癌進展中有重要作用[15]。Western blot 實驗結(jié)果表明，與對照組（0 μmol·L-1GLY）相比，GLY（200、400 μmol·L-1）組p-PI3K、p-AKT、AR 表達降低，AKT、PI3K 表達差異無統(tǒng)計學意義。與方芳等[16]結(jié)果相符。為進一步探究GLY 抑制前列腺癌的增殖是否與PI3K/AKT/AR 信號通路相關(guān)，加入PI3K 抑制劑WM，結(jié)果表明，200 μmol·L-1GLY 組、10 μmol·L-1WM 組、200 μmol·L-1GLY 與10 μmol·L-1WM 聯(lián)合處理組p-PI3K、p-AKT、AR 表達均下調(diào)，凋亡相關(guān)蛋白Bax、c-Caspase3 表達升高，Bax/Bcl-2 比值升高，Bcl-2 表達降低。提示GLY 對前列腺癌細胞C4-2B 促凋亡作用，其機制可能與PI3K/AKT/AR信號通路有關(guān)。

綜上所述，GLY 抑制C4-2B 細胞增殖、促進其凋亡可能與抑制PI3K/AKT/AR 信號通路有關(guān)。本研究有望為GLY 應用于前列腺癌臨床CRPC 期的治療提供一定的理論支持。