王玉軍， 王 珍， 趙天琪， 侯紹章

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，銀川 750004）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，是終末期腎病的主要原因[1]。研究顯示，在DN 早期，當系膜細胞和內(nèi)皮細胞尚未改變時就已出現(xiàn)足細胞損傷，表現(xiàn)為足細胞數(shù)量減少，胞體縮小，足突增寬融合、消失，進而引起蛋白尿，導(dǎo)致腎功能惡化進展[2-3]。因此，足細胞損傷被認為是DN 的主要原因之一。

鐵死亡（ferroptosis）是一種新型的細胞程序死亡方式，是由于細胞內(nèi)鐵依賴脂質(zhì)活性氧積聚過多而發(fā)生的一種可調(diào)節(jié)性細胞死亡形式[4]。研究顯示，鐵死亡在DN 發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[5]。因此，鐵死亡有望成為DN 臨床治療和相關(guān)藥物研發(fā)的一個新靶點。

傳統(tǒng)的DN 治療方法如控制飲食、降低血糖水平以及藥物治療[6]的效果有限，并不能夠延緩或阻止DN 的進展[7]。近年來，從中草藥中尋找治療DN 可能的方法和藥物成為防治DN 的研究熱點。甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是從甘草中提取的含量最高的皂苷類成分，研究表明，GA 表現(xiàn)出諸如抗?jié)?、祛痰、抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗腫瘤、神經(jīng)保護和增強免疫等多種藥理作用[8-10]。課題組前期研究顯示，GA 對DN 具有一定的保護作用[11-13]，但GA 能否通過影響DN 足細胞損傷發(fā)揮保護作用尚不明確。本研究通過建立細胞實驗，采用高糖誘導(dǎo)足細胞損傷模擬DN，探索GA能否通過調(diào)控鐵死亡對高糖誘導(dǎo)足細胞損傷起保護作用，以進一步為DN 的治療積累理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠腎小球足細胞購于上海中喬新舟生物科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購于武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清（FBS）購于以色列BI 公司；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）（含酚紅）及甘草酸（純度：HPLC≥98%）購于北京索萊寶科技有限公司；重組小鼠γ-干擾素（interferon，γ-IFN）購于美國PeproTech公司；D-葡萄糖購于生工生物工程（上海）股份有限公司；CCK-8 試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；伊紅染色液購于北京索萊寶科技有限公司；改良Lillie-Mayer 蘇木素染色液購于北京雷根生物技術(shù)有限公司；抗體Nephrin 購于英國Abcam 公司；抗體GPX4、GAPDH、Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP 購于Affinity 公司；DyLight 594，Goat Anti-Rabbit IgG 購于Abbkine 公司；BCA 蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液及SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；ROS 熒光探針-DHE 購于威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司；封閉用正常山羊血清、中性樹膠購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 將小鼠腎小球足細胞迅速從-80 ℃冰箱中取出，于37 ℃水浴鍋中解凍后常規(guī)復(fù)蘇，置于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素和100 U·mL-1重組小鼠γ-干擾素的RPMI1640培養(yǎng)基，于33 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)分化，使用10%胎牛血清、1%青鏈霉素和不含γ-IFN的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d 左右。當細胞融合達到80%，使用無血清培養(yǎng)基同步化處理24 h，將細胞隨機分為正常對照組（NG，葡萄糖5.5 mmol·L-1）、高糖組（HG，葡萄糖30 mmol·L-1）和高糖+甘草酸組（HG+GA，葡萄糖30 mmol·L-1、甘草酸100 μmol·L-1），各組細胞均培養(yǎng)48 h。

1.2.2 細胞活性檢測 將細胞密度以2×103個/孔接種于96 孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，按照1.2.1 做細胞分組處理，各組設(shè)5 個復(fù)孔，根據(jù)試劑盒說明書加入CCK-8 溶液，繼續(xù)避光孵育2 h，用酶標儀于450 nm 處讀取吸光度值，根據(jù)公式計算細胞活力：細胞活力=（實驗組OD 值-空白組OD 值/對照組OD 值-空白組OD 值）×100%。

1.2.3 HE 染色 將細胞密度以1×104個/孔接種于24 孔板內(nèi)無菌玻片上，進行細胞爬片，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，按照1.2.1做細胞分組處理，依次使用95%乙醇固定、蘇木素染色液染核、伊紅染色液染胞質(zhì)，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.4 Western blot 檢測蛋白表達 將各組干預(yù)好的細胞置于冰上，PBS 清洗3 次，加入RIPA 裂解液于冰上裂解30 min，用細胞刮子搜集各組細胞，轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃高速離心10 min，吸取上清液，用BCA 蛋白定量試劑盒測定各組蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸10 min 使蛋白變性，取各組蛋白40 μg，用8%SDSPAGE 凝膠進行電泳（60 V/100 V）。于4 ℃條件下，用200 mA 電流根據(jù)目的蛋白分子量大小轉(zhuǎn)膜相應(yīng)時間，使蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。5%脫脂牛奶溶液室溫封閉2 h，TBST 清洗3 次，分別加入一抗Nephrin（1∶1000）、GPX4（1∶1000）、GAPDH（1∶1 000），于4 ℃孵育過夜。次日復(fù)溫后TBST 洗膜3 次，加入HRP 標記的二抗（1∶3 000），室溫孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次，使用ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影，GAPDH 作為內(nèi)參，用軟件Image-J 進行灰度值分析，計算蛋白相對表達量。

1.2.5 免疫熒光染色 將干預(yù)好的細胞棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次，使用4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min，PBS 洗滌3 次，0.1%Triton X-100室溫透化細胞膜，使用山羊血清室溫封閉45 min，棄掉血清，加入適量一抗GPX4（1∶250）于4℃條件下孵育過夜，次日復(fù)溫后，PBS 洗滌3 次，加入熒光二抗（1∶250）于37℃條件下避光孵育1 h，PBS 洗滌3 次，使用抗熒光衰減封片劑（含DAPI）封片，熒光顯微鏡下觀察、攝圖。

1.2.6 ROS 測定 吸凈24 孔板內(nèi)的細胞培養(yǎng)基，用RPMI1640 培養(yǎng)基清洗3 次，加入DHE 濃度為1 μmol·L-1的RPMI1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育0.5 h，結(jié)束后使用RPMI1640 培養(yǎng)基清洗3 次，于熒光顯微鏡下觀察細胞熒光著色、攝圖。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 23.0 和GraphPad Prism 8.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析及作圖，各組實驗獨立重復(fù)3 次，實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間兩兩比較采用Turkey 法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GA 對高糖環(huán)境下足細胞活力的影響

與NG 組相比，HG 組足細胞活力降低（P＜0.01）；與HG 組相比，HG+GA 組足細胞活力升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組足細胞活力比較

2.2 GA 對高糖環(huán)境下足細胞形態(tài)的影響

蘇木精-伊紅（HE）染色法檢測細胞形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果顯示：NG 組細胞呈長梭形，具有較多突起，由胞體分出許多樹枝樣分支；與NG 組細胞相比，HG 組細胞胞質(zhì)淡染，突觸減少，樹枝樣結(jié)構(gòu)明顯減少甚至消失；與HG 組相比，HG+GA 組細胞形態(tài)有一定程度的改善，與正常細胞形態(tài)基本相似，見圖2。

圖2 各組足細胞在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)（HE×400）

2.3 GA 對高糖環(huán)境下足細胞Nephrin 蛋白表達的影響

Western blot 實驗檢測Nephrin 蛋白表達，結(jié)果顯示：與NG 組相比，HG 組Nephrin 蛋白表達量降低（P＜0.001）；與HG 組相比，HG+GA 組Nephrin 蛋白表達量升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 Western blot 檢測各組足細胞Nephrin 的表達情況

2.4 GA 對高糖環(huán)境下足細胞GPX4 表達的影響

Westernblot 檢測GPX4 的表達結(jié)果顯示：與NG組相比，HG 組GPX4 蛋白表達量降低（P＜0.001）；與HG 組相比，HG+GA 組GPX4 蛋白表達量升高（P＜0.01），見圖4。

圖4 Western blot 檢測各組足細胞GPX4 的表達情況

2.5 GA 對高糖環(huán)境下足細胞GPX4 熒光強度的影響

免疫熒光檢測GPX4 的表達結(jié)果顯示：GPX4主要表達于細胞質(zhì)，與NG 組相比，HG 組GPX4 的熒光強度減弱（P＜0.01）；而與HG 組相比，HG+GA組GPX4 的熒光強度上調(diào)（P＜0.05），見圖5。

圖5 免疫熒光檢測各組足細胞GPX4 的定位及表達情況（×400）

2.6 GA 對高糖環(huán)境下足細胞ROS 表達的影響

活性氧（ROS）檢測試劑盒檢測足細胞內(nèi)ROS的含量結(jié)果顯示：NG 組僅有很低的ROS 熒光強度，與NG 組相比，HG 組ROS 熒光強度明顯增強；與HG 組相比，HG+GA 組ROS 熒光強度明顯減弱，見圖6。

圖6 各組足細胞ROS 的表達情況（×100）

3 討論

DN 的發(fā)病率比一般疾病高，且療效差，其特點主要以腎小球血管受損、硬化為主，臨床上表現(xiàn)為尿蛋白排泄量增加[14]。足細胞是終末分化的腎小球內(nèi)臟上皮細胞，可維持腎小球濾過屏障（GFB）的完整性，防止尿蛋白的丟失[15]。Nephrin 蛋白是足細胞特有的標志蛋白，同時也是重要的功能蛋白[16]。Nephrin 蛋白在裂孔隔膜上相互交叉，組成特有的拉鏈狀結(jié)構(gòu)，是阻止大分子蛋白質(zhì)漏出最為重要的結(jié)構(gòu)。此外，Nephrin 蛋白在介導(dǎo)一系列信號傳導(dǎo)、維持足細胞正常形態(tài)方面同樣起著十分重要的作用[17]。本次研究采用HG 誘導(dǎo)足細胞損傷構(gòu)建DN 體外細胞模型，結(jié)果顯示高糖環(huán)境下足細胞活力降低，細胞胞質(zhì)淡染，突觸減少，樹枝樣結(jié)構(gòu)明顯減少甚至消失，細胞失去原有的正常形態(tài)，Nephrin 蛋白表達水平降低。

GA 是從甘草中提取的含量最高的皂苷類成分，課題組前期研究表明，GA 對DN 具有一定的保護作用[11-13]，但其機制尚未完全闡明。本次研究顯示，GA 可提高高糖環(huán)境下足細胞活力，對細胞形態(tài)也有一定程度的改善作用，提高Nephrin 蛋白的表達水平，表明GA 可改善足細胞功能障礙。

鐵死亡是由鐵離子參與的脂質(zhì)過氧化物累積引起的，通過抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)Xcˉ進一步激活氧化應(yīng)激，ROS 的產(chǎn)生可誘導(dǎo)非細胞凋亡形式的鐵死亡[18]。鐵依賴的脂質(zhì)ROS的異常積累是鐵死亡的標志，也是鐵死亡的原因。鐵死亡與包括糖尿病在內(nèi)的各種嚴重的人類疾病有關(guān)[19]。作為一種抗氧化酶，GPX4 催化脂質(zhì)過氧化物的還原并間接干擾芬頓反應(yīng)，是鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子[20]。本次研究顯示，高糖環(huán)境下足細胞GPX4 蛋白表達水平降低，而ROS 升高。GA 干預(yù)則可提高GPX4 蛋白表達水平、降低ROS 的表達，表明GA 可抑制高糖環(huán)境下足細胞鐵死亡現(xiàn)象。

綜上所述，GA 可抑制高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷，從而延緩DN 并改善足細胞功能，其機制可能與抑制鐵死亡有關(guān)。