肖 靜， 尹 梅， 高小平， 曲 晨， 趙嘉慶

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區(qū)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心腦血管病醫(yī)院，銀川 750004； 4.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院耳鼻咽喉頸外科，銀川 750004；5.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

枸杞是一種傳統(tǒng)的中藥，普遍應(yīng)用于人們的日常保健[1]?？梢杂脕?lái)緩解視覺模糊、腹痛、干咳、疲勞、頭暈和頭痛等癥狀[2]，并且通過抗凋亡、降低DNA 損傷等延緩生物老化，是一種有效的抗衰老劑。枸杞果多糖（lycium barbarum polysaccharide，LBPs）作為枸杞的主要活性成分之一，在生物學(xué)上表現(xiàn)為降低血糖和神經(jīng)保護(hù)的功效[3]，具有有益健康的生理作用，包括免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗氧化的活性[3-4]。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，巨噬細(xì)胞可通過表型轉(zhuǎn)換來(lái)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞以兩種極化方式對(duì)環(huán)境信號(hào)作出反應(yīng)，包括經(jīng)典的促炎激活（M1）和替代的抗炎激活（M2）[5-8]。M1 巨噬細(xì)胞由干擾素-γ（IFNγ）、細(xì)菌脂多糖（LPS）或腫瘤壞死因子-α（TNFα）觸發(fā)，M1 巨噬細(xì)胞表達(dá)促炎因子，如白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1b、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible NOS，INOS）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、環(huán)氧化酶（COX）-2，促進(jìn)隨后的炎癥免疫反應(yīng)[9-13]。巨噬細(xì)胞在機(jī)體肺部的表型具有可塑性和復(fù)雜性。本課題組前期在動(dòng)物模型上證實(shí)了LBPs 可以通過減輕氣道炎癥及調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)調(diào)節(jié)小鼠免疫系統(tǒng)功能，但LBPs 是否具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能尚不清楚[14]。炎性反應(yīng)是一種復(fù)雜且高度協(xié)調(diào)的機(jī)制反應(yīng)，涉及分子、細(xì)胞和生理變化，巨噬細(xì)胞作為一種固有免疫細(xì)胞在炎癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15-16]。本研究以過敏性哮喘小鼠為模型，探究LBPs 對(duì)機(jī)體巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，并在LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型上進(jìn)一步探究不同濃度的LBPs 對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LBPs（含量為31%，濃度為1 200 mg·mL-1）由森淼公司提供；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的F4/80、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）-Cy7 熒光素（PE-Cy7）標(biāo)記的CD11b，購(gòu)自eBioscience；流式抗體PE 標(biāo)記的F4/80、別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）標(biāo)記的INOS 購(gòu)自Biolegend；小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保存委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；Ⅰ型膠原酶、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）購(gòu)自Sigma Aldrich；多聚甲醛購(gòu)自Absin。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋LDZX-75KBS（山東博科科學(xué)儀器有限公司）；超凈工作臺(tái)SJ-CJ-2FD（蘇潔醫(yī)療有限公司）；光學(xué)顯微鏡BX43（深圳市三利化學(xué)品有限公司）；GYXH-70 制冰機(jī)（廈門國(guó)儀科學(xué)儀器有限公司）；流式細(xì)胞儀（BD FACS Celesta）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及OVA 誘導(dǎo)的小鼠過敏性哮喘模型 30 只雌性小鼠BALB/C 購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，隨機(jī)分為磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）對(duì)照組、哮喘模型組、LBPs+哮喘模型組，每組10 只。小鼠過敏性哮喘模型的構(gòu)建共需4 周，前3 周為致敏階段，第4 周為激發(fā)階段，詳細(xì)造模方案參考文獻(xiàn)資料[14]，具體如下。將小鼠置于無(wú)菌的飼養(yǎng)條件下適應(yīng)2 周后開始實(shí)驗(yàn)，過敏性哮喘模型組小鼠及LBPs+哮喘模型組小鼠在第0、7、14 天腹腔注射由20 μg 的OVA 和2 mg 的氫氧化鋁凝膠配制成的200 μL 致敏液，PBS 組給予等量的PBS作為對(duì)照；在第21～28 天每天滴鼻1 mg·mL-1的OVA 激發(fā)液50 μL，PBS 組給予等量的PBS 作為對(duì)照。此外，LBPs 干預(yù)組從開始造模前2 周每天以100 mg·kg-1對(duì)小鼠進(jìn)行LBPs 灌胃直至死亡，PBS 組給予等量的PBS 作為對(duì)照。

1.3.2 小鼠肺部組織形態(tài)學(xué)變化觀察 造模完成后取每組6 只小鼠，在第29 天對(duì)小鼠使用1%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射充分麻醉后，打開胸腔摘取肺組織，使用無(wú)菌PBS 將表面的血漬清洗干凈后，分出小鼠的左側(cè)肺組織，先用多聚甲醛固定，再進(jìn)行石蠟包埋組織切片后使用蘇木精-伊紅（HE）染色20 倍觀察小鼠肺部組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3 小鼠肺組織單細(xì)胞懸液的制備 取出小鼠右肺，浸泡在1 mL 濃度為1 mg·mL-1的Ⅰ型膠原酶溶液中，充分剪碎后，37 ℃、180 r·min-1振蕩2 h。經(jīng)過300 目尼龍網(wǎng)膜過濾后得到單細(xì)胞懸液，直接加入3 mL 紅細(xì)胞裂解液，于冰上放置5 min后，4 ℃離心去除紅細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL 備用。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織總巨噬細(xì)胞以及M1 型巨噬細(xì)胞比例

從上述調(diào)好濃度的細(xì)胞懸液中取出100 μL進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)染色。每個(gè)樣本管中加入1 μL的FITC-F4/80 和1 μL 的PE-Cy7-CD11b 進(jìn)行表面染色，冰上孵育30 min、室溫固定30 min后邊破膜邊染色，加入1 μL 的別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）標(biāo)記的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）染色30 min后使用緩沖液洗滌2 次，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的高糖（high-glucose dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM）培養(yǎng)液中，不添加抗生素，置于含5%CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞形態(tài)，培養(yǎng)基變黃時(shí)提示需換液，每2～3 d 傳代1 次。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組和處理 實(shí)驗(yàn)主要分為5 組，即PBS 對(duì)照組，100 ng·mL-1LPS 誘導(dǎo)的M1 巨噬細(xì)胞炎癥模型組（M1 模型組），50、100、150 μg的LBPs 干預(yù)M1 巨噬細(xì)胞模型組（50 μg LBPs+M1模型組、100 μg LBPs+M1 模型組、150 μg LBPs+M1模型組）。每組5 個(gè)復(fù)孔。

以2×106個(gè)/孔的細(xì)胞鋪于6 孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后在LBPs 干預(yù)組中加入對(duì)應(yīng)含量的LBPs 干預(yù)，對(duì)照組和M1 模型組予以PBS 處理同樣的時(shí)間。8 h 后換用含有100 ng·mL-1的LPS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，對(duì)照組給予等量的PBS 處理。

1.4.3 觀察巨噬細(xì)胞分化形態(tài)變化 正常生長(zhǎng)的細(xì)胞大部分為圓形，經(jīng)過LPS 誘導(dǎo)活化后的M1 型細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則的多邊形，培養(yǎng)24 h 后，吸盡培養(yǎng)液，使用顯微鏡觀察每組細(xì)胞的分化形態(tài)變化并對(duì)每個(gè)孔細(xì)胞進(jìn)行拍照。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各分組中M1 巨噬細(xì)胞的比例 收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，使用無(wú)菌PBS將6 孔板洗滌3 次后，每孔加入500 μL提前37 ℃預(yù)熱的0.25%胰酶放于培養(yǎng)箱消化3 min，顯微鏡下觀察到大量細(xì)胞成團(tuán)塊狀飄起來(lái)時(shí)，加入500 μL 提前配制好的完全培養(yǎng)基終止消化，使用移液器將輕柔團(tuán)塊吹成單細(xì)胞。牛鮑式計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整濃度后取1×106個(gè)細(xì)胞于流式管，加入1 μL PE 標(biāo)記的抗小鼠F4/80 染色30 min后室溫固定30 min，加入破膜液和1 μL APC 標(biāo)記的INOS 抗體冰上避光孵育30 min，邊破膜邊染色，經(jīng)染色緩沖液洗滌后用300 μL 緩沖液重懸細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)M1 細(xì)胞（F4/80+INOS）的比例變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 5.0 軟件進(jìn)行分析并作圖，計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組內(nèi)兩兩比較使用LSD-t 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理變化

在PBS 對(duì)照組中，小鼠支氣管上皮細(xì)胞排列整齊，周圍無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡細(xì)胞上皮壁較薄，支氣管管腔平滑松弛，未見明顯黏液分泌；而在哮喘模型組中，可以看到支氣管和血管周圍有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜上皮細(xì)胞變形，平滑肌增生明顯，管腔狹窄，管壁增厚，大量杯狀細(xì)胞聚集于肺泡內(nèi)。在經(jīng)過LBPs 干預(yù)后，肺組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少、肺組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，黏膜增生程度較哮喘模型組減輕，見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化（HE×20，Bar=20 μm）

2.2 各組小鼠肺總巨噬細(xì)胞數(shù)量的變化

與PBS 對(duì)照組（4.43%）相比，哮喘模型組肺部總巨噬細(xì)胞比例增加至6.99%（P＜0.05）；與哮喘模型組比較，經(jīng)過LBPs 干預(yù)后，小鼠肺部總巨噬細(xì)胞的比例下降至5.51%（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組小鼠肺部總巨噬細(xì)胞數(shù)量的變化

2.3 各組小鼠肺部M1 細(xì)胞的占比比較

在OVA 誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠中，INOS 高表達(dá)的M1 型巨噬細(xì)胞的占比增加。與PBS 對(duì)照組相比，哮喘模型組M1 型巨噬細(xì)胞占比（7.79%）增加（P＜0.05）；LBPs+哮喘模型組（4.36%）與PBS對(duì)照組M1 型巨噬細(xì)胞占比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與哮喘模型組相比，LBPs+哮喘模型組的M1 型巨噬細(xì)胞的占比下降（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組小鼠肺部M1 細(xì)胞占比比較

2.4 巨噬細(xì)胞分化形態(tài)變化

對(duì)照組細(xì)胞呈圓形，形似葡萄串。與PBS 對(duì)照組對(duì)比，M1 模型組多數(shù)細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則形狀，并且伴有大量觸角，分化情況嚴(yán)重；經(jīng)LBPs干預(yù)后的實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞形態(tài)趨于正常，見圖4。

圖4 巨噬細(xì)胞分化形態(tài)變化（HE×40）

2.5 各組RAW264.7 巨噬細(xì)胞中M1 細(xì)胞的比例比較

經(jīng)過LPS 誘導(dǎo)后，M1 巨噬細(xì)胞的占比增加（P＜0.05）。在LBPs 干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組中，M1 的細(xì)胞比例呈劑量依賴式下降。與PBS 對(duì)照組相比，M1模型組和三種劑量LBPs+M1 型巨噬細(xì)胞的數(shù)量均增加（P 均＜0.05）；與M1 模型組（57.1%）比較，50、100、150 μg 的LBPs 干預(yù)組，M1 細(xì)胞的比例分別下降至52.3%、51.4%和46.9%（P均＜0.05）。

圖5 各組RAW264.7 巨噬細(xì)胞中M1 細(xì)胞占比比較

3 討論

巨噬細(xì)胞是固有免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)控者，作為一種可在肺組織中存在的免疫細(xì)胞，能夠調(diào)控機(jī)體免疫平衡和防御病原體。巨噬細(xì)胞還是一個(gè)極其異質(zhì)性的群體，在暴露于微環(huán)境刺激后可以極化，不同表型的巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)多種疾病中的炎性反應(yīng)，其中M1 巨噬細(xì)胞具有促炎作用，而M2 巨噬細(xì)胞與抗炎反應(yīng)相關(guān)，因此巨噬細(xì)胞顯示出促炎和抗炎功能的兩面性[17-18]。巨噬細(xì)胞極化伴隨著機(jī)體環(huán)境的變化調(diào)控，涉及多種細(xì)胞因子、趨化因子、信號(hào)分子，在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。

哮喘是一種異質(zhì)性疾病，其特征是患者肺內(nèi)氣流阻塞，臨床上表現(xiàn)為呼吸急促、喘息和胸悶，是由可變氣流限制導(dǎo)致的[17]。巨噬細(xì)胞M1/M2 表型變化在該病發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，研究[18]表明，在OVA 誘導(dǎo)的哮喘模型中可以通過改變M1 和M2 的細(xì)胞比例（具體表現(xiàn)為減少M(fèi)1 細(xì)胞比例和增加M2 細(xì)胞比例）來(lái)緩解小鼠的哮喘氣道炎癥。同時(shí)有證據(jù)[17，19-20]顯示，在過敏性疾病中功能失調(diào)的巨噬細(xì)胞與哮喘的進(jìn)展密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞作為一種天然免疫細(xì)胞，存在于身體的各個(gè)部分，是呼吸系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞之一，可以作為機(jī)體的第一道防線抵抗微生物的入侵，并且可以通過多種途徑參與機(jī)體的炎性反應(yīng)和組織修復(fù)[19-21]。此外，哮喘患者使用糖皮質(zhì)激素治療可調(diào)節(jié)氣道巨噬細(xì)胞功能，其主要原理是通過減少巨噬細(xì)胞活性氧（ROS）的形成來(lái)降低哮喘氣道中的氧化應(yīng)激[22]。由此可見，在過敏性哮喘中減少巨噬細(xì)胞的數(shù)量可能是一種有效緩解哮喘癥狀的措施。

LPS 作為大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，由于能夠觸發(fā)炎癥過程中的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使得RAW264.7 巨噬細(xì)胞極化為促炎表型的經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞（M1 巨噬細(xì)胞）[23]。其主要的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)為，與未活化的RAW264.7 巨噬細(xì)胞相比，其形態(tài)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形或者不規(guī)則多邊形，而未活化的細(xì)胞主要呈現(xiàn)為形態(tài)均一的圓形[24]。巨噬細(xì)胞中的一氧化氮（nitronic oxide，NO）水平與巨噬細(xì)胞的免疫活性密切相關(guān)，NO 是活化的巨噬細(xì)胞殺死致病性微生物和腫瘤細(xì)胞的主要途徑，但過量的NO 也會(huì)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的分泌，iNOS 是體內(nèi)產(chǎn)生NO 的關(guān)鍵酶[25-26]。在本文中，RAW264.7 巨噬細(xì)胞可以通過LPS 誘導(dǎo)成高表達(dá)iNOS 的M1 細(xì)胞表型，M1 細(xì)胞作為一種典型的促進(jìn)炎癥的細(xì)胞表型，可以分泌大量促炎因子、趨化因子等，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生急性適應(yīng)性免疫應(yīng)答[26-27]。

植物多糖多為大分子多糖，研究[28-29]表明，多糖（仙人掌多糖、羊棲菜多糖等）可以通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)的分子發(fā)揮免疫學(xué)功能，植物多糖可以促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的作用。一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的研究發(fā)現(xiàn)[30]，黃芪多糖（APS）可以顯著抑制巨噬細(xì)胞M1 的標(biāo)記物表達(dá)，從而可以改善EAE炎癥反應(yīng)的微環(huán)境。本課題組前期以O(shè)VA 誘導(dǎo)的哮喘為模型進(jìn)行LBPs 干預(yù)發(fā)現(xiàn)，LBPs 可以調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的平衡，具體表現(xiàn)為降低哮喘致病機(jī)制的Th2 型免疫應(yīng)答（模型組Th2 細(xì)胞比例為7.2%，干預(yù)LBPs 后小鼠Th2 比例下降至2.0%）[31]。

本研究結(jié)果顯示，LBPs 可以緩解過敏性哮喘小鼠肺部炎癥水平，減少小鼠肺部總巨噬細(xì)胞和M1 巨噬細(xì)胞的占比，與課題組前期的研究結(jié)論（LBPs 具有的抗炎作用）一致[14，31]。進(jìn)一步在LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞炎癥水平實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了LBPs 可以減少巨噬細(xì)胞的M1 巨噬細(xì)胞的占比，說明LBPs 具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫功能的作用。巨噬細(xì)胞是一種機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞，本研究證實(shí)LBPs 能夠緩解巨噬細(xì)胞的炎癥水平，LBPs 緩解巨噬細(xì)胞炎癥水平的具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。