張家赫，史佳琪，陳章健，賈 光

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

二氧化鈦(titanium dioxide, TiO2)作為一種食品添加劑應(yīng)用已久。1966年，美國(guó)食品與藥物管理局正式認(rèn)可TiO2作為食品添加劑，最高允許添加量為1%[1]。我國(guó)國(guó)家健康衛(wèi)生委員會(huì)(原衛(wèi)生部)在食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)(GB2760-2014)中規(guī)定TiO2可以作為食品添加劑適量使用，飲料和糖果中最高允許添加量為10 g/L。但隨著時(shí)代的發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步，納米二氧化鈦(titanium dioxide nanoparticles，TiO2NPs)已大量存在于食品級(jí)TiO2中，占據(jù)總顆粒數(shù)的17%～35%[2]。據(jù)報(bào)道，北京市20～30歲人群每天消化道TiO2NPs攝入量為0.02～3.09 μg/kg[3]。TiO2NPs經(jīng)消化道攝入可能在人體組織中蓄積，并產(chǎn)生健康風(fēng)險(xiǎn)，如氧化應(yīng)激、組織病理學(xué)改變、致癌作用、遺傳毒性、生殖毒性和免疫破壞等[4]，但機(jī)制尚未完全明確。此外，TiO2NPs具有良好的抗菌能力，對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌具有抑制生長(zhǎng)和殺滅的作用[5-7]，因此，TiO2NPs對(duì)人消化道尤其是腸道菌群的影響值得關(guān)注。人體腸道菌群對(duì)于宿主能量與代謝平衡以及身體健康的影響已經(jīng)受到科學(xué)界廣泛關(guān)注和探索，人類腸道正常菌群通過(guò)多種免疫因子與腸道免疫系統(tǒng)形成動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，失衡時(shí)可能引起各種負(fù)面健康效應(yīng)。

目前已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示TiO2NPs經(jīng)口攝入可以對(duì)腸道菌群產(chǎn)生影響，主要影響乳酸桿菌(Lactobacillus)等厚壁菌門(Firmicutes)細(xì)菌的相對(duì)豐度[8-13]。然而腸道菌群的組成在物種之間甚至同物種的不同品系之間存在明顯差異[14]，導(dǎo)致動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至人體時(shí)具有局限性。而體外消化道微生態(tài)模擬系統(tǒng)提供了一種可能的直接研究人源腸道菌群的實(shí)驗(yàn)方式，常見(jiàn)的體外消化道微生態(tài)模擬系統(tǒng)可以分為單相靜態(tài)、半連續(xù)動(dòng)態(tài)和多相連續(xù)動(dòng)態(tài)模擬系統(tǒng)。1993年，Molly等[15]提出了人類腸道微生態(tài)模擬系統(tǒng)(simulation of human intestinal microbial ecosystem，SHIME)，這種連續(xù)動(dòng)態(tài)模擬系統(tǒng)采用5個(gè)部分模擬了胃、小腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸的微生態(tài)，被應(yīng)用于食品醫(yī)藥[16]、重金屬污染[17]等腸道菌群相關(guān)研究。各種體外模擬系統(tǒng)不斷經(jīng)歷優(yōu)化和改進(jìn)，較好地模擬人體消化道微生態(tài)，在腸道菌群研究領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展應(yīng)用前景。本文參考SHIME等已有模型構(gòu)建了體外人消化道微生態(tài)模擬系統(tǒng)，研究TiO2NPs對(duì)人源腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 TiO2 NPs的理化表征

TiO2NPs購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。使用透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM；JEM-1400，JEOL公司，日本)觀察顆粒的形狀和平均粒徑；通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass pectrometry，ICP-MS；IRIS Advantag，美國(guó))檢測(cè)顆粒純度；使用X射線衍射儀(X-ray powder diffractometry，XRD；PANalytical’s X’Pert PRO，荷蘭)測(cè)量晶型；使用BET(Brunauer-Emmett-Teller)法測(cè)量比表面積；通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS；ZetaSizer Nano ZS90，英國(guó))測(cè)量TiO2NPs(1 g/L)的水合粒徑和Zeta電位。

1.2 人源腸道菌群提取

參考葉峰等[18]的方法提取和保存糞便菌群。糞便菌群供體為1位健康成人志愿者(24周歲男性，無(wú)慢性消化道疾病及其他病史，半年內(nèi)未服用過(guò)抗生素類藥物)。取新鮮糞便約5 g加入25 mL磷酸鹽緩沖液，混勻后4 ℃靜置1 min，取上清液10 mL，4 ℃下1 500 r/min離心3 min，上清液為菌群提取液，放入超凈臺(tái)備用。

1.3 人消化道微生態(tài)體外模擬系統(tǒng)構(gòu)建

1.3.1溶液配置 營(yíng)養(yǎng)液：腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(青島海博生物)；模擬胃液：氯化鈉3 g/L、胃蛋白酶3.2 g/L、36.5%(體積分?jǐn)?shù))濃鹽酸7 ml/L，pH測(cè)定為1.40；模擬胰液：碳酸氫鈉12.5 g/L、牛膽汁6 g/L、豬胰素粉0.9 g/L，pH測(cè)定為8.16。

1.3.2體外模擬流程 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的模擬系統(tǒng)是在SHIME基礎(chǔ)上簡(jiǎn)化的三相半連續(xù)動(dòng)態(tài)模擬系統(tǒng)。模擬過(guò)程完整模擬TiO2NPs經(jīng)口攝入后逐步進(jìn)入胃、小腸和結(jié)腸，并在結(jié)腸階段與腸道菌群相互作用的整個(gè)過(guò)程。整個(gè)模擬過(guò)程在同一培養(yǎng)瓶中進(jìn)行，通過(guò)改變液體環(huán)境模擬胃、小腸、結(jié)腸階段，因此屬于三相半連續(xù)動(dòng)態(tài)模擬系統(tǒng)。模擬過(guò)程從胃模擬階段開(kāi)始，用模擬營(yíng)養(yǎng)液和TiO2NPs染毒液模擬納米顆粒和食物混合經(jīng)口攝入的過(guò)程，其被加入到模擬胃液中，而后加入模擬胰液進(jìn)入小腸階段，最后加入提前穩(wěn)定培養(yǎng)的菌液，模擬結(jié)腸階段(圖1)。整個(gè)體外模擬系統(tǒng)由電熱套保證恒溫，細(xì)胞培養(yǎng)瓶密封并用厭氧產(chǎn)氣袋保證無(wú)氧環(huán)境，培養(yǎng)過(guò)程中采用搖床以60～70 r/min模擬腸道蠕動(dòng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程在超凈臺(tái)中進(jìn)行。

TiO2 NPs, titanium dioxide nanoparticles.CNC, computer numerical control.

1.3.3系統(tǒng)穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程中菌群內(nèi)主要細(xì)菌：腸球菌(Enterococci)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和乳酸桿菌的生長(zhǎng)曲線，初步評(píng)價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)方法如下：取1 mL菌群提取液，在不加TiO2NPs染毒的情況下，按上述體外模擬系統(tǒng)流程培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)的第0、12、24、36、48 h，從體系中吸取菌液，分別接種在腸球菌、大腸桿菌和乳酸桿菌的選擇性培養(yǎng)基上，按適宜條件培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。膽鹽七葉苷瓊脂培養(yǎng)基(bile esculin agar，BEA)用來(lái)選擇性培養(yǎng)腸球菌，伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(eosin-methylene blue medium，EMB)用來(lái)選擇性培養(yǎng)大腸桿菌，乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(Lactobacillusselective agar，LBS)用來(lái)選擇性培養(yǎng)乳酸桿菌。

1.4 TiO2 NPs染毒

參考人群日常暴露劑量[3, 19]和體外細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果[20-21]，設(shè)置染毒劑量的最低值為20 mg/L，并以5為組距設(shè)置中高劑量組。

在胃階段向模擬系統(tǒng)中加入不同量的TiO2NPs，在結(jié)腸模擬階段加入提前培養(yǎng)穩(wěn)定的菌液，使最終TiO2NPs的染毒濃度為0、20、100、500 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)16 h染毒結(jié)束。對(duì)照組(0 mg/L)和TiO2NPs低(20 mg/L)、中(100 mg/L)、高(500 mg/L)劑量染毒組各設(shè)置3個(gè)平行樣。每個(gè)樣本均收集1 mL染毒結(jié)束時(shí)的菌群培養(yǎng)液于凍存管中，短暫放于-20 ℃冰箱后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存待測(cè)。

1.5 菌群16S rRNA測(cè)序

取1 mL菌液凍干去除水分后采用十六烷基三甲基溴化銨法進(jìn)行菌群基因組DNA提取，并利用1%(10 g/L)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。使用稀釋后的基因組DNA作為模板，使用合成帶有Barcode的特異引物(針對(duì)V4區(qū)域的515F和826R，針對(duì)V3+V4區(qū)域的341F和806R)和96孔熱循環(huán)(HID VeritiTM96-Well Thermal Cycler)PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增目的條帶大小，并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化。得到擴(kuò)增條帶后使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集，利用氫氧化鈉變性產(chǎn)生單鏈DNA片段，構(gòu)建形成Miseq文庫(kù)。使用Ion S5 XL測(cè)序儀進(jìn)行單端測(cè)序，根據(jù)熒光信號(hào)結(jié)果獲知Miseq文庫(kù)中模板DNA片段序列。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)導(dǎo)出為Fastq格式文件。利用Trimmomatic軟件采用滑動(dòng)窗口對(duì)序列進(jìn)行篩選和保留，利用Flash和Pear軟件對(duì)具有重疊(overlap)的序列進(jìn)行拼接，最小重疊區(qū)域10 bp，錯(cuò)配率0.1，得到初始文件(Fasta)序列。根據(jù)已知數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.drive5.com/uchime/uchime_download.html)用uchime方法比對(duì)去除Fasta序列的嵌合體，對(duì)于未知數(shù)據(jù)庫(kù)使用自比對(duì)(denovo)方法進(jìn)行去除，同時(shí)去除不合要求的短序列。采用Qiime和vsearch軟件進(jìn)行聚類歸組分析，將優(yōu)質(zhì)序列(clean tags)聚類分為許多操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，對(duì)97%相似水平下的OTUs進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，聚類方法采用uparse聚類法；采用Qiime和Uclust Consensus Taxon Assigner軟件對(duì)OTUs代表序列在各個(gè)水平(界kingdom、門phylum、綱class、目order、科family、屬genus、種species)注釋其群落的物種信息。

對(duì)各樣本組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，采用mothur和Qiime軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析；采用Qiime和R軟件進(jìn)行Beta多樣性分析；采用R軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)和線性判別效應(yīng)量分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)，根據(jù)線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)得分評(píng)估各組間的物種差異并尋找組間差異的腸道菌；采用PICRUSt 2.0軟件，根據(jù)京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，對(duì)基因序列的功能豐度進(jìn)行預(yù)測(cè)。

其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)和Bartlett方差齊性檢驗(yàn)，連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基于同一樣本來(lái)源的3次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所有檢測(cè)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，并以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TiO2 NPs表征

TiO2NPs的表征結(jié)果顯示，TiO2NPs粒徑為球形，直徑為(25.12±5.64)nm，純度為99.99%，晶體結(jié)構(gòu)為銳鈦礦，比表面積(77.51±0.29)m2/g，在超純水中水合粒徑為(609.43±60.35)nm，Zeta電位為(-8.33±0.22)mV。

2.2 系統(tǒng)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果

選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果如圖2所示。在0～24 h，各類細(xì)菌數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，在24～48 h維持相對(duì)穩(wěn)定，并在48 h時(shí)顯示出下降趨勢(shì)(圖2)，這說(shuō)明本模擬系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，在培養(yǎng)24 h時(shí)即能達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定，且穩(wěn)定狀態(tài)可以保持24 h。在24 h，BEA顯示腸球菌計(jì)數(shù)達(dá)到(1.6±0.85)×107個(gè)，EMB顯示大腸桿菌計(jì)數(shù)達(dá)到(5.6±0.82)×107個(gè)，LBS顯示乳酸桿菌計(jì)數(shù)達(dá)到(2.7±1.32)×107個(gè)。

本研究中體外消化道模擬系統(tǒng)培養(yǎng)24 h后腸球菌、大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量轉(zhuǎn)化為以10為底的對(duì)數(shù)值分別為7.17±0.28、7.74±0.07、7.40±0.20。SHIME模型[15]中，培養(yǎng)穩(wěn)定時(shí)對(duì)應(yīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)(以10為底的對(duì)數(shù)值)分別為7.33±0.38、7.69±0.71、6.58±0.78。與SHIME模型相比，本研究所用的體外消化道模擬系統(tǒng)在腸球菌和大腸桿菌計(jì)數(shù)上相近，初步判斷穩(wěn)定性較好。

2.3 腸道菌群組成分析

2.3.1OTUs聚類分析 OTUs是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元(品系、屬、種、分組等)設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志。通過(guò)歸類操作(cluster)，共產(chǎn)生223個(gè)OTUs。按組分，各樣本組共有的OTUs數(shù)目為143個(gè)，對(duì)照組、20 mg/L TiO2NPs劑量組、100 mg/L TiO2NPs劑量組、500 mg/L TiO2NPs劑量組分別具有獨(dú)特的OTUs數(shù)目為2、0、1、3個(gè)，TiO2NPs染毒組共有而對(duì)照組沒(méi)有的OTUs有50個(gè)(圖3A)。按樣本分，各樣本共有的OTUs數(shù)目為87個(gè)(圖3B)。說(shuō)明對(duì)照組和TiO2NPs染毒組OTUs不同，提示菌種組成存在差異。

The sample names and operational taxonomic units(OTUs)quantity of each part are marked in the figure.Low, 20 mg/L TiO2 NPs; Middle, 100 mg/L TiO2 NPs; High, 500 mg/L TiO2 NPs.

2.3.2物種組成分析 對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行對(duì)比分析，并在各個(gè)生物學(xué)分類水平注釋其群落的物種信息。根據(jù)分類分析結(jié)果可以得知樣本或樣本組間在各分類水平上的分類學(xué)對(duì)比情況，反映了樣本中微生物的種類和相對(duì)豐度?；赨nweighted Unifrac距離矩陣，UPGMA方法聚類建樹(shù)，并將聚類結(jié)果與各樣品在門、綱、目、科、屬水平上的物種相對(duì)豐度整合展示為圖4。在門水平上，4組均以變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門為主(圖4A)。在綱水平上，對(duì)照組以γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和Negativicutes菌綱為主，低、中、高TiO2NPs染毒組均以γ-變形菌綱和梭菌綱(Clostridia)為主(圖4B)，對(duì)照組的各樣本彼此間更為接近。在目(圖4C)和科(圖4D)水平上，TiO2NPs染毒組之間表現(xiàn)出分離的趨勢(shì)。在屬水平上，大腸埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)等細(xì)菌在各組間表現(xiàn)出相對(duì)豐度的差異(圖4E)。

In the proportional bar charts, each color represents a species of bacteria at the corresponding level(the same color represents different bacteria at diffe-rent levels), and the length of each color block represents the relative abundance of the corresponding bacteria.On the left side of the bar charts it is showed the results of clustering each sample according to the similarity degree of strain composition.

2.4 腸道菌群物種多樣性分析

2.4.1Alpha多樣性分析 群落生態(tài)學(xué)中研究微生物多樣性，通過(guò)單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，包括一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性。Chao1和Observed species指數(shù)主要反映樣本的物種豐富度信息，Shannon和Simpson綜合體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度，PD whole tree兼顧物種豐富度和進(jìn)化距離。TiO2NPs染毒組的Chao1、Observed species和PD whole tree均顯著高于對(duì)照組，而對(duì)照組在Shannon和Simpson指數(shù)上與TiO2NPs染毒組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各指數(shù)具體分布見(jiàn)圖5。

Low, 20 mg/L TiO2 NPs; Middle, 100 mg/L TiO2 NPs; High, 500 mg/L TiO2 NPs.*P<0.01, #P<0.001, vs. control.

2.4.2Beta多樣性分析 主成分分析(principal component analysis，PCA)結(jié)果見(jiàn)圖6A，PCA前兩個(gè)主成分解釋方差的百分比分別為63.15%和14.57%，共計(jì)77.82%，圖中表現(xiàn)出對(duì)照組與TiO2NPs染毒組顯著分離。利用偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)構(gòu)建模型(圖6B)，可見(jiàn)前兩個(gè)主坐標(biāo)可解釋的方差百分比分別為36.08%和8.62%，共計(jì)42.70%，對(duì)照組和TiO2NPs染毒組的分離趨勢(shì)明顯可見(jiàn)。以上結(jié)果表明，TiO2NPs改變了腸道菌群的beta多樣性，使得TiO2NPs染毒組與對(duì)照組的菌群結(jié)構(gòu)和組成產(chǎn)生了顯著差異。

Low, 20 mg/L TiO2 NPs; Middle, 100 mg/L TiO2 NPs; High, 500 mg/L TiO2 NPs; PC, principal component; PCA, principal component analysis; PLS-DA, partial least squares discrimination analysis.

2.5 差異腸道菌群篩選

采用LEfSe分析可以找到組間在豐度上有顯著差異的物種，其結(jié)果由原始數(shù)據(jù)柱狀圖和分支進(jìn)化圖展示(圖7)。以LDA得分>3為標(biāo)準(zhǔn)，共篩出42個(gè)在TiO2NPs染毒組和對(duì)照組中存在顯著差異的細(xì)菌種類，其中包括擬桿菌門(Bacteroidetes)，放線菌綱(Actinobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、擬桿菌綱(Bacteroidetes)3個(gè)菌綱，擬桿菌目(Bacteroi-dales)、梭菌目(Clostridiales)、乳桿菌目(Lactobacillales)、巴斯德氏菌目(Pasteurellales)4個(gè)菌目，擬桿菌科(Bacteroidaceae)、雙歧桿菌科(Bifidobacteria-ceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)等9個(gè)菌科，擬桿菌屬(Bacteroides)、腸桿菌屬、腸球菌屬、優(yōu)桿菌屬(Eubacterium)等17個(gè)菌屬以及陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)等8個(gè)菌種。

2.6 差異腸道菌群功能預(yù)測(cè)

利用PICRUSt 2.0軟件，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)16S rRNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG基因注釋，并預(yù)測(cè)相關(guān)通路和功能。結(jié)果提示，共有14種功能和通路具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖8)，包括“氧化磷酸化”“能量代謝”“磷酸鹽和磷酸鹽代謝”“甲烷代謝”“真核生物中的核糖體發(fā)生”“環(huán)境適應(yīng)”“蛋白酶體”“消化系統(tǒng)”“植物-病原相互作用”“傳染?。杭?xì)菌”“免疫疾病”“蛋白質(zhì)消化吸收”“阿米巴病”“系統(tǒng)性紅斑狼瘡”等。

The ordinate represents the 14 functions and pathways with statistical differences, and the ordinate shows the corresponding-lgP values.

3 討論

本研究通過(guò)體外消化道微生態(tài)模擬方法研究了TiO2NPs對(duì)人源腸道菌群的影響。體外模擬系統(tǒng)從液體環(huán)境、有機(jī)物和無(wú)機(jī)鹽、寄生菌群、外部環(huán)境等多方面盡可能地還原人體消化道微生態(tài)，具有簡(jiǎn)便快速、相對(duì)廉價(jià)、符合醫(yī)學(xué)倫理和可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)。目前，體外模擬系統(tǒng)已經(jīng)在營(yíng)養(yǎng)學(xué)、藥理學(xué)和食品化學(xué)等領(lǐng)域得到認(rèn)可和廣泛應(yīng)用，但在納米材料領(lǐng)域還未得到廣泛應(yīng)用[22]。Dudefoi等[23]利用SHIME模型培養(yǎng)人工混合的菌群，發(fā)現(xiàn)TiO2NPs對(duì)細(xì)菌群落影響有限，卵形擬桿菌(Bacteroidesovatus)豐度降低，而耳蝸形梭菌(Clostridiumcocleatum)豐度增加。MET-1菌群是由33種標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌混合的用于糞菌移植治療的模擬菌群，與本研究所用的直接人來(lái)源的糞便菌群有所不同。但本研究也同樣發(fā)現(xiàn)了3種擬桿菌屬的細(xì)菌(Bacteroidessalyersiae，Bacteroidessp.MarseilleP2653，BacteroidesuniformisdnLKV2)和一種梭菌(ClostridiabacteriumUC5.1-2G4)在對(duì)照組和TiO2NPs染毒組之間存在顯著的豐度差異，這提示擬桿菌和梭菌可能是TiO2NPs影響的關(guān)鍵人源菌種。體外模擬系統(tǒng)難以完全模擬復(fù)雜的體內(nèi)生理過(guò)程，不得不在準(zhǔn)確性和易用性之間妥協(xié)，這需要在今后的研究和應(yīng)用中繼續(xù)優(yōu)化改進(jìn)。

TiO2NPs可以改變影響腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)，影響益生菌的相對(duì)豐度，進(jìn)而影響機(jī)體代謝和功能。腸道益生菌是一類對(duì)宿主有益的腸道細(xì)菌，主要包括乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和革蘭氏陽(yáng)性球菌(Gram-positive cocci)。本研究發(fā)現(xiàn)腸道益生菌在TiO2NPs染毒組和對(duì)照組間存在顯著差異，包括乳酸桿菌屬和兩種雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis，Bifidobacte-riumlongum)。與對(duì)照組相比，高劑量TiO2NPs染毒組中乳酸桿菌增加而雙歧桿菌減少。在大鼠體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)得到了相似的結(jié)果[9-10]，但在小鼠中的部分研究則發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌相對(duì)豐度減少或不變[11-12]。此外，在其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中表現(xiàn)出差異的勞森菌(Lawsonia)或生絲微菌屬(Hyphomicrobium)等在本研究中均未被發(fā)現(xiàn)。正常人腸道菌群中占比最多的細(xì)菌屬是擬桿菌屬、梭菌屬、消化球菌屬(Peptococcus)、雙歧桿菌屬、真桿菌屬(Eubacterium)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)和消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)[24]，其中擬桿菌屬等在本研究中表現(xiàn)出受到TiO2NPs的顯著影響。同時(shí)，TiO2NPs還可能通過(guò)改變腸道菌群影響機(jī)體能量代謝和免疫功能。本研究通過(guò)PICRUSt功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs對(duì)腸道菌群的影響可能引起氧化磷酸化等能量代謝改變、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫功能異常以及其他多種代謝和功能變化。TiO2NPs在亞急性和亞慢性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均可引起免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致小腸炎性浸潤(rùn)[9]、上皮細(xì)胞形態(tài)改變[25]、連接蛋白合成受阻[26]等，并可通過(guò)血液循環(huán)產(chǎn)生肝、腎、脾等器官損傷[27]。本研究提示，TiO2NPs消化道暴露可能改變?nèi)梭w腸道菌群中的益生菌及其他主要細(xì)菌的相對(duì)豐度，從而影響人體健康。

綜上所述，體外人消化道微生態(tài)模擬系統(tǒng)下TiO2NPs可以影響人源腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)，改變其中益生菌等多種細(xì)菌的相對(duì)豐度，并可能影響機(jī)體的代謝和功能。體外人消化道微生態(tài)模擬系統(tǒng)在納米材料消化道暴露后對(duì)人源腸道菌群的影響研究中具有較好的應(yīng)用前景。