林世團, 王曉雪, 陳冉
1. 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室, 中國科學院南海海洋研究所, 廣東 廣州 510301;
2. 中國科學院大學, 北京 100049
藍細菌(Cyanobacteria), 也被稱為藍藻或藍綠藻, 屬于革蘭氏陰性菌(Sinha et al, 2008)。藍細菌能利用葉綠素、胡蘿卜素等光合色素進行光合作用,是地球上一類能進行放氧光合作用的原核生物(Aguilera et al, 2021)。藍細菌種類豐富, 分布廣泛且形態(tài)多樣, 包含6 個目2000 多個種(Stanier et al,1977)。浮游藍細菌是海洋食物網(wǎng)的主要生產(chǎn)者, 是全球碳循環(huán)和氮循環(huán)中不可或缺的角色(Bullerjahn et al, 2014; Tang et al, 2019)。此外, 藍細菌具有生長速度快、遺傳操作簡單和生理功能多樣等特性, 是研究生物基因型(Do Carmo Bittencourt-Oliveira et al,2012; G?ga?a et al, 2014; Belykh et al, 2015; Song et al, 2015)、表型(Berrendero et al, 2011; Dojani et al,2014)和生態(tài)型(D’Agostino et al, 2014; Chandler et al,2016; Marston et al, 2016; Sohm et al, 2016)之間關(guān)系的重要模式生物。
集胞藻PCC6803(Synechocystissp. PCC6803)和聚球藻WH7803(Synechococcussp. WH7803)分別是研究淡水和海水藍細菌的模式菌株。單細胞淡水集胞藻PCC6803 是首個完成基因組序列測定的藍細菌(Kaneko et al, 1995, 1996)?;蚪M大小為3573471bp(base pair), 每個細胞具有12 個基因組拷貝(Labarre et al, 1989), 編碼3317 個基因。集胞藻PCC6803 還具有7 個環(huán)形質(zhì)粒, 大小在2.3~119kb 之間(Chauvat et al, 1986; Prindle, 2015)。海水藍細菌與淡水藍細菌親緣關(guān)系較遠, 主要成員為原綠球藻(Prochlorococcus)和聚球藻兩個屬。原綠球藻主要分布營養(yǎng)貧乏的溫暖海域, 而聚球藻的生態(tài)分布更為廣泛, 從赤道的溫暖海域到次極地低溫水域, 從富營養(yǎng)的河口到寡營養(yǎng)的海洋水域。聚球藻是一種超微型單細胞原核藻類, 大小僅為1~2μm(Partensky et al, 1999), 因而直到1979 年才得以在海洋中被發(fā)現(xiàn)。目前研究的海洋聚球藻的大多數(shù)為單倍體, 僅含有單個染色體。然而海洋聚球藻WH7803 的染色體具有多個拷貝,一般含有4 個染色體拷貝, 基因組大小為2366980bp。
毒素-抗毒素(toxin-antitoxin, TA)系統(tǒng)是原核系統(tǒng)中由相鄰的2 個或3 個基因組成的基因元件。其中毒素基因編碼毒素蛋白, 起到抑菌或殺菌功能,而抗毒素基因編碼蛋白或RNA, 通過直接或間接作用拮抗毒素的毒性(Dorman et al, 2001)。毒素-抗毒素系統(tǒng)具有多種功能, 包括能夠調(diào)節(jié)細胞代謝水平對抗外界的生長壓力、參與細胞程序性死亡、參與“持留菌”形成、參與生物被膜形成以及抵御噬菌體侵染等生物過程(Wang et al, 2011)。目前依據(jù)抗毒素與毒素作用方式的不同, 將毒素-抗毒素系統(tǒng)分為7 種類型 (Ⅰ型至Ⅶ型)(Wang et al, 2021)。Ⅱ型毒素-抗毒素系統(tǒng)中毒素和抗毒素皆為蛋白質(zhì), 通過毒素和抗毒素間的蛋白-蛋白的互作抑制毒素的毒性作用。
毒素-抗毒素系統(tǒng)的系統(tǒng)發(fā)育分析表明, 藍細菌基因組分布著大量的毒素-抗毒素系統(tǒng)(Akarsu et al,2019)。然而目前只有極少數(shù)藍細菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)被研究?;谒{細菌生態(tài)位置的重要性和毒素-抗毒素功能的多樣性, 我們以淡水藍細菌集胞藻PCC6803 和海水藍細菌聚球藻WH7803 作為研究對象, 對其基因組進行了毒素-抗毒素系統(tǒng)預測。并且選取集胞藻PCC6803 的5 對和聚球藻WH7803 的2 對毒素-抗毒素系統(tǒng)進行毒性驗證并對其蛋白進行異源表達純化。實驗結(jié)果表明, 集胞藻PCC6803 的兩對毒素- 抗毒素系統(tǒng) BAD01932-1933 和BAA18559-New ORF7 的毒素具有明顯的細胞毒性,且抗毒素能中和毒素毒性, 與預測結(jié)果相符。本文的研究結(jié)果將有助于后續(xù)對藍細菌毒素-抗毒素系統(tǒng)及其生態(tài)和生物學功能的研究。
1.1.1 菌株與培養(yǎng)基
實驗所用的克隆模板集胞藻PCC6803 和聚球藻WH7803 基因組DNA 分別由中國科學院水生生物研究所張承才教授和香港科技大學曾慶璐教授饋贈?;蚩寺『偷鞍妆磉_所用的菌株大腸桿菌(Escherichia coli) K12 BW25113, ER2738 和BL21(DE3) 均為本實驗室保存, 培養(yǎng)條件為37℃條件下Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基培養(yǎng)。菌株培養(yǎng)使用的抗生素為羧芐青霉素和硫酸卡那霉素, 工作濃度分別為100μg·mL-1和50μg·mL-1。
1.1.2 主要試劑
DNA 限制性核酸內(nèi)切酶購于NEB 公司(伊普斯威奇, 美國); 基因片段和載體同源重組使用的非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒(ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit)購自諾唯贊公司(南京, 中國); DNA 凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購買自 OMEGA 公司(諾克羅斯, 美國); DNA 提取試劑盒購于天根公司(北京, 中國)。PCR 引物由天一輝遠公司(廣州, 中國)合成。蛋白純化過程中所使用的Ni-NTA 親和柱料購自 Qiagen 公司(杜塞爾多夫,德國)。
集胞藻PCC6803 和聚球藻WH7803 菌株中TA的預測主要結(jié)合以下兩種策略: (1)下載TADB 數(shù)據(jù)庫 (Altschul, 1997)(https://bioinfo-mml.sjtu.edu.cn/TADB2/index.php)中已知的TA 蛋白序列, 通過本地 BLASTP 檢索這兩種菌株中和已知 TA 相似的蛋白序列(參數(shù): -evalue 1e-5); (2)兩種菌株的全部蛋白序列用InterProScan(version 5.35-74.0)對蛋白結(jié)構(gòu)域(Pfam domain)進行注釋, 根據(jù)已知 TA 的結(jié)構(gòu)域初步篩選潛在TA。上述兩種TA 預測的結(jié)果再進一步根據(jù)基因上下游“關(guān)聯(lián)犯罪”原則(guilt-byassociation)(Leplae et al, 2011)進行篩選, 對于明確具有毒素或者抗毒素結(jié)構(gòu)域的但是上下游又沒有符合條件的基因, 利用NCBI 數(shù)據(jù)庫在線工具ORF finder 對其上下游進行預測分析潛在的新的開放閱讀框(open reading frames, ORFs), 再結(jié)合結(jié)構(gòu)域注釋確定菌株中未注釋的新TA。所有備選基因通過Xtalpred 網(wǎng)站(https://xtalpred.godziklab.org/XtalPredcgi/xtal.pl)進行已解析結(jié)構(gòu)的同類型蛋白的檢索和比對分析, 根據(jù)檢索結(jié)果確定備選基因類型。
分別選取預測結(jié)果中集胞藻PCC6803 的5 對和聚球藻WH7803 的2 對毒素-抗毒素系統(tǒng)進行驗證。將這7 對毒素-抗毒素系統(tǒng)的毒素(BAA17887, New ORF7, BAD01872, BAD01932, BAD01997,SynWH7803_1121, SynWH7803_1701) 和抗毒素(BAA17887, BAA18559, BAD01871, BAD01933,BAD01998, SynWH7803_1122, SynWH7803_1700)以及相對應毒素-抗毒素合體的編碼區(qū)采用附表1 中的引物進行擴增, 使用one-step 方法連接至 pBAD質(zhì)粒。再將連接產(chǎn)物通過化學轉(zhuǎn)化的方法, 轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌 BW25113 中, 并使用含羧芐青霉素的 LB 平板進行重組菌株篩選。使用 pBAD-f(5′-ATGCCATAGCATTTTTATCCA-3′) 和 pBAD-r(5′-TCT GATTTAATCTGTATCAGG-3′)進行PCR 驗證, 選取大小正確的克隆測序確認。用于蛋白表達的重組菌株BL21(DE3)/pET28b(+)的構(gòu)建過程與上述相同。采用附表1 中的引物pUC19- pro-BAD1932-1933-f(5′-GAAAAAGAAGAATTGATGATGT-3′) 和pUC19-pro-BAD1932-1933-r(5′-CTAAAAGAGTC TTTCCACCGAT-3′)擴增毒素-抗毒素系統(tǒng) BAD 1932-1933 及其啟動子區(qū), 使用one-step 方法連接至pUC19 質(zhì)粒上。再將連接產(chǎn)物通過化學轉(zhuǎn)化的方法,轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌ER2738 中, 并使用含羧芐青霉素的LB 平板進行重組菌株篩選, 隨后使用M13-f和M13-r 通用引物PCR 驗證并測序。最后將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒通過化學轉(zhuǎn)化的方法, 轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BW25113 中,使用M13-f 和M13-r 進行PCR 驗證。
附表1 本文所用引物Tab. S1 Primers used in this study
將過夜培養(yǎng)的重組菌株菌液用接種環(huán)分別劃線于含羧芐青霉素和0.3% L-阿拉伯糖的LB 平板, 并同時劃線于不含0.3% L-阿拉伯糖, 僅含羧芐青霉素的LB 平板作為對照, 于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,拍照記錄結(jié)果。
pBAD 質(zhì)粒連接的重組菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜, 以初始濃度OD600≈0.1 轉(zhuǎn)接到裝有25mL 含有羧芐青霉素的 LB 液體培養(yǎng)基的錐形瓶,并加入 0.3% L-阿拉伯糖進行誘導表達。分別取誘導 0、2、4、6 和8h 的菌液作梯度稀釋, 并取各梯度10μL 稀釋液點至LB 平板, 在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜, 拍照記錄并計算菌落形成單位(colony-forming units, CFU)。同時分別取誘導后0、2、4、6 和8h 的菌液測定 OD600, 并使用GraphPad Prism 8 軟件進行生長曲線的繪制。
將攜帶 pUC19-BAD01932-33 重組質(zhì)粒和pUC19 空質(zhì)粒的BW25113 菌株于含羧芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng), 以初始濃度OD600≈0.1轉(zhuǎn)接到3mL 含羧芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)12h 后, 取菌液進行梯度稀釋, 并分別取10μL各梯度的稀釋液點在含羧芐青霉素和不含羧芐青霉素的LB 平板上, 該時間點記為0h。以0h 的菌液作為母液, 以1‰的體積比轉(zhuǎn)接至3mL LB 液體培養(yǎng)基中, 每隔12h 取菌液進行梯度稀釋, 并分別取10μL各梯度的稀釋液點在含羧芐青霉素和不含羧芐青霉素的LB 平板上。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜, 拍照記錄并計算CFU。并使用GraphPad Prism 8 軟件進行質(zhì)粒穩(wěn)定性曲線的繪制。
從NCBI 網(wǎng)站下載所需蛋白序列, 采用Clustal X2 軟件進行序列比對, 再將比對生成的文件上傳至EsPript3.0 網(wǎng)站(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi) 進行比對結(jié)果的展示。
將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21(DE3)中。將轉(zhuǎn)化板置于37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng), 第二天挑單菌落到20mL LB 培養(yǎng)基中, 加入硫酸卡那霉素, 37℃恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)過夜。次日取出過夜培養(yǎng)的20mL LB 培養(yǎng)基, 以1:100 的接種量接到500mL 培養(yǎng)基中, 加入硫酸卡那霉素, 37℃恒溫震蕩培養(yǎng)至 OD600達到 0.6~0.8, 加入終濃度為0.3mmol·L-1的異丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG), 放入37℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 培養(yǎng)5h, 誘導目的蛋白表達。
蛋白純化步驟由菌液離心及菌體重懸、超聲破碎、高速離心、Ni-NTA 填料平衡、上清與填料結(jié)合、蛋白鎳離子金屬鰲合親和層析介質(zhì)(Ni-NTA)等步驟組成。具體純化步驟如下:
1) 菌體重懸: 誘導5h 后的菌液離心去上清,沉淀用30mL Ni-NTA 緩沖液A 緩沖液重懸菌體到50mL 離心管中, 渦旋震蕩充分混勻后加入終濃度為1mmol·L-1的苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)和 5mmol·L-1的β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol, β-Me);
2) 超聲破碎: 超聲強度為75%, 破碎10s, 間隔5s, 冰上破碎120s。取4μL菌液加入到400mL Bradford中, 如果Bradford 變藍, 則說明菌體已破碎好;
3) 高速離心: 將超聲破碎過后的菌液 4℃,23500×g, 離心1h, 分離上清與沉淀;
4) Ni-NTA 填料平衡: 取1mL 柱料, 3434 ×g 離心60s 后去除上清。管底柱料先用2 倍柱體積的Ni-NTA 緩沖液B 平衡Ni-NTA 填料。接著再用2倍柱體積的Ni-NTA 緩沖液A 平衡填料;
5) 上清與填料結(jié)合: 蛋白高速離心結(jié)束后, 將上清倒入50mL 離心管, 用吸管吸取2mL 上清重懸平衡好的填料, 再一起轉(zhuǎn)移到50mL 離心管; 4℃,低速旋轉(zhuǎn)結(jié)合1h。先使用低濃度咪唑的緩沖液對結(jié)合到Ni-NTA 填料上的雜蛋白進行洗脫, 然后采用不同濃度的高濃度咪唑緩沖液進行梯度洗脫。收集的樣品使用Tricine-SDS-PAGE 電泳檢測蛋白的表達和洗脫情況。
通過數(shù)據(jù)庫檢索和本地比對, 預測結(jié)果顯示,集胞藻 PCC6803 含有 51 對潛在的 TA, 聚球藻WH7803 只有潛在的10 對TA(見附表2、3)。并且根據(jù)集胞藻 PCC6803 的預測結(jié)果, 在不成對的毒素基因或者抗毒素基因上下游分析尋找配對的抗毒素和毒素基因, 得到了9 個未注釋的開放閱讀框,命名為New ORF1-9。基于預測結(jié)果, 我們進行了不同類型 TA 的數(shù)量統(tǒng)計分析。分析結(jié)果表明, 集胞藻PCC6803 質(zhì)粒分布有23 對, 基因組分布有 28對 TA(圖 1a)。VapBC(23 對)、HicAB(9 對)和HigAB(4 對)系統(tǒng)是集胞藻PCC6803 基因預測的TA系統(tǒng)分布最多的三種類型(圖 1b)。相比于集胞藻PCC6803, 聚球藻WH7803 基因組上的毒素-抗毒素系統(tǒng)分布較少, 僅有10 對(見附表3)。
附表2 集胞藻. PCC6803 毒素-抗毒素系統(tǒng)預測信息Tab. S2 Prediction information of toxin-antitoxin systems in Synechocystis sp. PCC6803
續(xù)表
依據(jù)編碼基因的大小和方向, 兩個基因位置是否存在重疊以及與典型TA 結(jié)構(gòu)域和與同類型成員的序列相似度分析結(jié)果, 我們分別選取了集胞藻 PCC6803 預測結(jié)果中的 5 對 TA 和聚球藻WH7803 預測結(jié)果中的2 對 TA 進行進一步的分析和毒性實驗驗證(表1)。選取的集胞藻PCC6803 的5 對 TA 分別是: 位于質(zhì)粒 pSYSM 中的BAD01871-72、BAD01932-93、BAD01997-98和位于基因組中的BAA17887、BAA18559-New ORF7。BAA17887基因編碼的蛋白預測為HicAB 融合蛋白,進一步分析發(fā)現(xiàn)其N 端1~58 個氨基酸殘基為HicA毒素蛋白, C 端 59~136 個氨基酸為HicB 抗毒素蛋白。另外,BAA18559-New ORF7中的毒素基因New ORF7在之前的報道中并沒有得到注釋, 為本文新注釋的開放閱讀框。選取的聚球藻 SynWH7803_1121-22 和SynWH7803_1700-01 兩對TA 系統(tǒng)均位于基因組上。其余預測得到的TA 系統(tǒng)信息見附表2、3。
表1 本文選取的7 對毒素-抗毒素系統(tǒng)預測信息。Tab. 1 Prediction information of seven TA systems selected in this paper
實驗結(jié)果表明, 過表達集胞藻PCC6803 毒素-抗毒素系統(tǒng)BAD01932-33 和BAA18559-New ORF7的毒素BAD01932 和New ORF7 時會對大腸桿菌BW25113 造成明顯的生長抑制。而誘導表達合體BAD01932-1933 和BAA18559-New ORF7 可以解除毒素BAD01932 和New ORF7 的生長抑制毒性(圖2a、b)。因此, BAD01932-1933 和BAA18559-New ORF7 與預測結(jié)果相符, 組成毒素-抗毒素系統(tǒng)。而選取的其余5 對毒素-抗毒素系統(tǒng)在含有50μg·mL-1卡那霉素和0.3%L-阿拉伯糖LB 平板均未表現(xiàn)出明顯的毒性(圖2c—g)。
進行毒性鑒定的 7 對毒素-抗毒素系統(tǒng)中,BAD01932-1933 和BAA18559-New ORF7 能夠在大腸桿菌BW25113 中表現(xiàn)出毒性, 說明大腸桿菌中存在這兩個系統(tǒng)與原宿主中毒素蛋白相同或相近的底物。另外5 對系統(tǒng)沒有表現(xiàn)出異源宿主的毒性, 可能的原因是大腸桿菌中不存在這幾個系統(tǒng)的底物,也有可能是這幾個系統(tǒng)在大腸桿菌中不能表達, 所以仍需要在藍細菌宿主中進一步確認。
毒素-抗毒素系統(tǒng)具有維持質(zhì)粒穩(wěn)定性的生理功能在 1986 年被揭示(Gerdes et al, 1986)。BAD01932-33 分布于集胞藻 PCC6803 的質(zhì)粒上,推測可能與質(zhì)粒穩(wěn)定性的維持有關(guān)。為了驗證該設想, 我們將 BAD01932-33 構(gòu)建至pUC19 質(zhì)粒上,在E.coli進行質(zhì)粒穩(wěn)定性測定。結(jié)果表明, 傳代48h后pUC19 質(zhì)粒丟失95%, 而帶有BAD01932-333 的pUC19 質(zhì)粒在傳代72h 后仍有 80% 細菌宿主攜帶pUC19 質(zhì)粒(圖3)。這說明BAD01932-33 能夠明顯增加pUC19 在E. coli中的穩(wěn)定性。
鑒于選取的 7 對 TA 中 BAD01932-33 和BAA18559-New ORF7 毒素蛋白具有細胞毒性, 我們對其蛋白進行結(jié)構(gòu)域和功能分析。BAD01932 的分析結(jié)果為GNAT 家族毒素蛋白。該蛋白家族目前研究得較為透徹的成員包括: 沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的TacAT 系統(tǒng)(Cheverton et al, 2016),福氏志賀菌(Shigella flexneri)的 GmvAT 系統(tǒng)(McVicker et al, 2017), 腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli, EHEC) O157: H7 的AtaRT 系統(tǒng)(Jur?nas et al, 2017), 肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumonia)的 KacAT 系統(tǒng)(Qian et al,2019)和大腸桿菌的ItaRT 系統(tǒng)(Wilcox et al, 2018)。我們將 BAD01932 與AtaRT、TacAT、KacAT、ItaRT和GmvAT 系統(tǒng)中毒素蛋白的序列比對, 結(jié)果表明BAD01932 與其他同類型的毒素成員具有一定的序列相似度, 較為保守, 其中與AtaT 的相似度最高(33%)。該家族中發(fā)揮重要的底物識別和催化功能的氨基酸殘基為Tyr82、Arg92、Gly105 和Tyr141, 保守性高, 說明可能具有類似的催化機制(圖4a)。
New ORF7 預測為HicAB 家族的毒素蛋白, 該蛋白家族研究得較為透徹的成員包括鼠疫桿菌(Yersinia Pestis)(Goulard et al, 2010)、類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei)(Butt et al, 2014)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(Kim et al,2018)和大腸桿菌的 HicAB 系統(tǒng)(J?rgensen et al,2009)。這四個物種的抗毒素蛋白HicB 單體以及HicAB 復合物的蛋白結(jié)構(gòu)都已被解析, 但僅有類鼻疽伯克霍爾德菌的毒素蛋白HicA 的蛋白結(jié)構(gòu)得到解析, 因此毒素蛋白HicA 的催化機制并不明確。鼠疫桿菌、類鼻疽伯克霍爾德菌、肺炎鏈球菌和大腸桿菌的HicAB 系統(tǒng)HicA 蛋白都屬于同一個蛋白家族(PF07927)全長約為60 個氨基酸殘基。本文新注釋的New ORF7 所編碼的HicA 蛋白與類鼻疽伯克霍爾德菌的HicA 蛋白相似度最高(20%), 較為特殊的是New ORF7 所編碼的HicA 蛋白的N 端多出約50 個氨基酸。盡管如此Gly78 和His80 這兩個在同家族成員的催化過程起重要作用的殘基仍然較為保守, 這也說明它們可能具有相似的催化機制(圖4b)。
為了進一步驗證BAD01932-33 和BAA18559-New ORF7 這兩對TA 系統(tǒng)中毒素和抗毒素蛋白的相互作用情況, 我們采用pET28b(+)載體進行兩對系統(tǒng)的毒素、抗毒素單獨以及合體的異源表達和純化。由于這兩個系統(tǒng)的毒素蛋白對宿主菌株有較強的毒性作用, 我們進行了大量嘗試, 均未成功構(gòu)建野生型的表達載體。因此實驗中只嘗試了抗毒素單獨以及與毒素共表達的情況。實驗結(jié)果表明,BAD01932-33 的抗毒素蛋白BAD01933 單獨表達以及毒素-抗毒素共表達菌株在加入IPTG 誘導之后都有目的蛋白分子量對應大小的過表達條帶產(chǎn)生(圖5a 泳道2 和圖4b 泳道2), 高濃度咪唑洗脫樣品中,只有單獨表達抗毒素蛋白的載體有極少量可溶性蛋白能夠被洗脫(圖5a 泳道6 和7)。而絕大部分的抗毒素蛋白以及毒素和抗毒素共表達蛋白幾乎全部在包涵體中(圖5a 泳道4 和圖5b 泳道4)。對誘導劑濃度、誘導時長和誘導溫度的改變以及進行毒素和抗毒素的密碼子優(yōu)化都未能提高可溶性蛋白量。
BAA18559-New ORF7 TA 系統(tǒng)中抗毒素蛋白BAA18559 單獨表達菌株在加入誘導劑IPTG 后有過表達條帶(圖5c 泳道2), 但是仍以包涵體的形式存在(圖5c 泳道4), 以高濃度咪唑進行洗脫時仍沒有得到抗毒素蛋白BAA18559(圖5c 泳道6 和7)。而毒素蛋白New ORF7 和抗毒素蛋白BAA18559 共表達的菌株在加入誘導劑 IPTG 后都沒有出現(xiàn)明顯的過表達條帶(圖5d 泳道2)。這種情況的出現(xiàn)的原因可能是BAD01932-33 和BAA18559-New ORF7這兩對TA 系統(tǒng)的蛋白在大腸桿菌中表達時不能正確折疊, 或者是這些蛋白的溶解度本身偏低。
本文采用生物信息學方法預測了淡水藍細菌集胞藻PCC6803 和海水藍細菌聚球藻WH7803 的毒素-抗毒素系統(tǒng)。預測結(jié)果表明, 集胞藻PCC6803 具有51 對潛在的TA, 而聚球藻WH7803 具有10 對TA。出現(xiàn)這種差別的原因可能與兩種細菌所生存的環(huán)境的復雜性有關(guān), 集胞藻PCC6803 所生活的淡水中的微生物種類和數(shù)量較多, 水體隨季節(jié)變化存在較大溫差, 營養(yǎng)成分和種類受人類活動影響大, 而聚球藻WH7803 所生活的海洋環(huán)境的溫度和營養(yǎng)波動較小。而TA 系統(tǒng)的存在有利于菌體抵抗逆境和復雜生存環(huán)境, 因此更有利于集胞藻PCC6803 適應復雜多變的生態(tài)環(huán)境。由于本文僅分別預測分析了一種淡水藍細菌和海水藍細菌, 因此TA 系統(tǒng)在淡水和海水藍細菌基因組上的分布差異性還需要后續(xù)的研究分析。
VapBC (Vap: virulence associated protein, 毒力相關(guān)蛋白)類型的TA 系統(tǒng)在集胞藻PCC6803 所預測的51 對TA 系統(tǒng)分布最高, 為23 對。在原核生物中,VapC 家族成員大多數(shù)具有PIN 結(jié)構(gòu)域, 并在許多原核生物的基因組中大量存在, 如結(jié)核桿菌目前已發(fā)現(xiàn)超過48 對(Pandey et al, 2005; Ramage et al, 2009)。VapC 家族成員眾多, 但很多成員的底物目前并不清楚。已有的研究表明, 沙門氏菌、志賀氏菌和鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)中的VapC 蛋白能切割起始tRNAfMet, 并且均從特定的位點切割反密碼子環(huán)。所以VapC 能夠抑制細胞蛋白翻譯功能的起始(Winther et al, 2011; Lopes et al, 2014)。然而VapC 家族成員并非所有成員都通過切割tRNA 抑制蛋白的翻譯, 例如結(jié)核桿菌的VapC20 能通過切割23S rRNA 中保守的Sarcin-Ricin 環(huán)(SRL)抑制蛋白的翻譯(Winther et al, 2013)。
本文選取的毒素蛋白 BAD01932 和 New ORF7 在大腸桿菌BW25113 異源表達時具有細胞毒性。其中 BAD01932-33 位于集胞藻 PCC6803的質(zhì)粒上, 屬于一類新型Ⅱ型TA 系統(tǒng)。本文研究發(fā)現(xiàn), BAD01932-33 能夠明顯增加pUC19 在E.coli中的穩(wěn)定性。其毒素蛋白具有 GNAT 折疊,抗毒素蛋白具有Ribbon-Helix-Helix (RHH)折疊。GCN5-related N-acetyl-transferase (GNAT)來源于酵母菌GCN5 (general control non-depressible 5),是一種組氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶。在乙?;磻? 這類酶將乙酰-CoA 作為乙酰基供體。GNAT 超家族能夠?qū)Πǖ鞍踪|(zhì)、小分子代謝物和抗生素在內(nèi)的一系列底物進行乙?;揎? 例如賦予細菌對氨基糖苷類藥物產(chǎn)生抗性的氨基糖苷 N-乙?;D(zhuǎn)移酶就是第一個被鑒定的GNAT 超家族成員。腸出血性大腸桿菌O157: H7 的AtaT(Jur?nas et al,2017)和沙門氏菌的TacT(Cheverton et al, 2016)這兩種 GNAT 毒素的分子機理研究較為透徹,AtaT 通過將乙酰-CoA 的乙?;D(zhuǎn)移到Met-tRNAfMet從而抑制翻譯的進行。其他GNAT家族的毒素成員作用機制類似, 不同的是作用的tRNA 種類存在區(qū)別。
BAA18559-New ORF7 屬于HicAB 類, 也是一種Ⅱ型 T A 系統(tǒng)。最早發(fā)現(xiàn)于流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae) 的菌毛基因簇(hif)當中,因此被命名為 HicAB (Haemophilus influenza contiguous)。hicAB 基因排列有一個顯著的特點: 毒素基因hicA 位于抗毒素基因hicB 的前面, 這與大多數(shù)TA 系統(tǒng)的基因排列順序相反。hicAB 基因在細菌中分布廣泛, 常常多對存在, 具有多樣性??苟舅氐鞍譎icB 通常含有RNase H 樣折疊(典型特征包含β1β2β3α1β4α2 模塊), 而HicA 蛋白通常包含結(jié)合雙鏈RNA 的結(jié)構(gòu)域。第一對由實驗證實的HicAB 成員位于大腸桿菌 K-12 基因組中(J?rgensen et al,2009)。其HicA 蛋白是核糖體不依賴型的RNA 切割酶, 能夠?qū)Π麅?nèi)的mRNA 和tmRNA 酶切, 進而阻斷翻譯過程的進行, 具有抑菌功能。而HicB 并沒有表現(xiàn)出細胞毒性, 反而可以完全抑制HicA 的毒性。對HicAB 家族的后續(xù)研究發(fā)現(xiàn), 其主要的生理功能包括維持菌株毒力(Goulard et al, 2010), 介導“持留菌”的形成(Butt et al, 2014)和協(xié)助菌體適應細胞外應激(J?rgensen et al, 2009)。
Ⅱ型 TA 的毒素蛋白和抗毒素蛋白之間存在緊密的相互作用。抗毒素蛋白要與毒素蛋白的結(jié)合底物競爭, 所以毒素-抗毒素之間的相互作用一般強于毒素-底物之間的相互作用。毒素蛋白一般具有以下特點: 比抗毒素蛋白穩(wěn)定、水溶性不高和對宿主菌有毒性作用。而抗毒素分子的特點為:較不穩(wěn)定、極易降解、水溶性較毒素好以及能夠抑制毒素分子對宿主菌的毒性作用。因此在體外進行功能研究的時候要充分考慮毒素和抗毒素兩種分子的特性。本文采用大腸桿菌表達系統(tǒng)異源表達的BAD01932-33 和BAA18559-New ORF7 兩個系統(tǒng)的蛋白時發(fā)現(xiàn), BAD01932-33 系統(tǒng)單獨表達抗毒素時僅有少量可溶性蛋白, 表達合體時兩種蛋白均在包涵體中, 說明蛋白的水溶性較低是該系統(tǒng)異源表達純化的制約因素。而BAA18559-NewORF7 單獨表達抗毒素時蛋白全部在包涵體中, 表達合體時也只有抗毒素有誘導帶出現(xiàn), 毒素蛋白甚至沒有誘導帶產(chǎn)生, 可能是因為HicA 蛋白的毒性太強, 導致加入誘導劑之后出現(xiàn)基因突變而不能正常表達。
本文分別以集胞藻PCC6803 和聚球藻WH7803為研究對象, 通過生物信息學的方法預測了二者基因組和質(zhì)粒上的毒素-抗毒素系統(tǒng), 并通過實驗驗證了其中7 對潛在的系統(tǒng)。本文的研究結(jié)果為后續(xù)藍細菌毒素-抗毒素系統(tǒng)功能和應用研究的開展提供了理論依據(jù)。