康明明，田軼楠，鄭紅艷，張銘芙，潘云志

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科三病房，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科二病房，黑龍江齊齊哈爾 161000；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科二病房，黑龍江齊齊哈爾 161000；4.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)外科一病房，黑龍江齊齊哈爾 161000；5.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科一病房，黑龍江齊齊哈爾 161000

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）屬于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，一般為原發(fā)性惡性腫瘤，常在成年人中高發(fā)，具有發(fā)病率、致死率高，預(yù)后差的特點(diǎn)，是星形細(xì)胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療，臨床上廣泛應(yīng)用的一般以手術(shù)、 放化療及分子靶向等治療為主要趨勢(shì)， 即便如此仍不能緩解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性進(jìn)展趨勢(shì)[1-4]。 長(zhǎng)鏈非編碼RNA 是一種長(zhǎng)度大于200 nt 的內(nèi)源性非編碼性RNA， 由RNA 聚合酶所轉(zhuǎn)錄[5]。UNC5B-AS1 是lncRNA 家族的成員之一，而且它是血管內(nèi)皮素的受體之一，由于其特殊性，它參與到介導(dǎo)netrin-1 的排斥作用中，這些蛋白質(zhì)參與細(xì)胞的促凋亡及抗細(xì)胞凋亡過(guò)程。 UNC5B 對(duì)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有著一定調(diào)控作用[6]，而UNC5B-AS1 作為UNC5B 的反義鏈， 可能也具有與UNC5B 相似的生物學(xué)功能， 可能對(duì)腫瘤的發(fā)展也有一定的影響基于此， 該研究在該院2021 年1—3 月住院并進(jìn)行手術(shù)治療的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者中方便收集30 例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織樣本及鄰近瘤旁組織樣本。 通過(guò)觀察對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA UNC5B-AS1 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況， 探討UNC5B-AS1 對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及作用機(jī)制，以期能夠?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤的診療過(guò)程提供幫助?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本

在該院住院并進(jìn)行手術(shù)治療的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者中方便收集30 例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織樣本及鄰近瘤旁組織樣本。組織離體后在液氮中進(jìn)行快速冷凍，在臨床樣本實(shí)驗(yàn)前對(duì)其進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色鑒定。該研究已經(jīng)獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并在取樣時(shí)得到了患者許可。

1.2 細(xì)胞株

人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株購(gòu)于美國(guó)ATCC 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

在37℃，5%CO2的條件下，在含有2.5%FBS、5%馬血清的DMEM-F12 的培養(yǎng)基中加入人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，每3 天換液一次，直到細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后接種于6 孔板中。使用轉(zhuǎn)染效率穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h 時(shí)，收集細(xì)胞檢測(cè)合格后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 RT-qPCR 檢測(cè)

將實(shí)驗(yàn)需要的細(xì)胞組織用TRIzol 法提取總RNA， 然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 在10 μl 定量PCR 反應(yīng)體系條件下，其中cDNA 2 μl，2×Master Mix 0.5 μl，10 μM 的上下游引物各0.5 μl，加ddH2O 至10 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火60 s，40 個(gè)循環(huán)。 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，95℃10 s、60℃60 s、95℃15 s，以建立PCR 產(chǎn)物的熔解曲線。 數(shù)據(jù)采用公式2-△△Ct方法計(jì)算。

1.5 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株置于96 孔板中，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，然后向每個(gè)孔中加入10 μl CCK-8 試劑并進(jìn)行混勻， 同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。 在37℃避光條件下，孵育1 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm 的吸光度值。

1.6 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株置于24 孔板中，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h。 使用胰酶消化細(xì)胞株并用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸， 使用臺(tái)盼藍(lán)染色技術(shù)調(diào)整細(xì)胞密度， 然后取細(xì)胞懸液100 μl 加于Transwell 小室上層向，小室下層加入500 μl 10%血清完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24 h 后取出，PBS 清洗后取出未發(fā)生遷移的細(xì)胞。 4%多聚甲醛固定20 min，充分洗滌，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，充分洗滌后隨機(jī)分5 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

將解凍好的50 μl 液態(tài)基質(zhì)膠用400 μl 無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋并搖勻， 取50 μl 的稀釋液置于Transwell 小室的上室中，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待凝固后再加入100 μl 無(wú)血清培養(yǎng)基浸潤(rùn)凝膠， 吸棄，后續(xù)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)操作相同， 通過(guò)計(jì)數(shù)穿模細(xì)胞數(shù)來(lái)反映細(xì)胞的侵襲能力。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株， 將細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h。用不含EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min。 PBS 磷酸鹽緩沖液漂洗細(xì)胞2 次，1 000 r/min 離心5 min， 收集細(xì)胞。 500 μl Binding buffer， 加入5 μl 的Annexin V-FITC 混勻每個(gè)樣本再加入5 μl 的PI 混勻，室溫避光孵育15 min，移入流式管中上機(jī)檢測(cè)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率。

1.8 Western Blot 檢測(cè)蛋白的表達(dá)

提取細(xì)胞中的總蛋白。 制備濃度為12%分離膠及5%濃縮膠的聚丙烯酰胺凝膠。 取20 μg 蛋白上樣，恒流電泳35 mA；將激活的PVDF 膜轉(zhuǎn)移緩沖液與凝膠一起置于電轉(zhuǎn)移緩沖液，在冰上且穩(wěn)壓100 V條件下轉(zhuǎn)移約2 h。 結(jié)束后， 將PVDF 膜放入TBST中洗滌充分，后置于雜交袋中（5%脫脂奶粉）室溫封閉1 h。 再次洗滌充分， 然后加入適當(dāng)稀釋的抗體，4℃孵育過(guò)夜， 用TBST 洗滌2 次，15 min/次，將PVDF 膜置于1∶2 000 稀釋的HRP 標(biāo)記的IgG 中，室溫放置1 h 后，用TBST 洗滌2 次，15 min/次，按ECL 顯色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以（±s）表示，不符合正態(tài)分布的用中位數(shù)和四分位數(shù)表示。 多組比較用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)的秩和檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn) （或Fisher精確檢驗(yàn)）和配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，相關(guān)性的分析采用Spearman 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UNC5B-AS1 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織及瘤旁組織中的表達(dá)情況

RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果表明， 與瘤旁組織比較，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中UNC5B-AS1 的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 UNC5B-AS1 基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的生物學(xué)行為影響

在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株細(xì)胞中根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別進(jìn)行敲除UNC5B-AS1 和過(guò)表達(dá)UNC5B-AS1 操作，通過(guò)CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UNC5B-AS1 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖情況的影響， 結(jié)果中顯示，UNC5BAS1 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖情況無(wú)顯著影響（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)UNC5B-AS1 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡情況的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，敲除UNC5B-AS1 組膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡率明顯明顯升高， 過(guò)表達(dá)UNC5B-AS1 組膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。敲除UNC5B-AS1 能夠促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡， 而過(guò)表達(dá)UNC5B-AS1 能夠顯著抑制其細(xì)胞凋亡。

Transwell 檢測(cè)UNC5B-AS1 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移侵襲能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，敲除UNC5B-AS1 組膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力明顯明顯增加， 過(guò)表達(dá)UNC5B-AS1 組膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。 敲除UNC5B-AS1 能夠促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移侵襲，而過(guò)表達(dá)UNC5 B-AS1 能夠顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移侵襲。

2.3 UNC5B-AS1 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中miRNAs 表達(dá)的影響

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與UNC5B-AS1 結(jié)合的miRNAs，通過(guò)RT-qPCR 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中的預(yù)測(cè)的miRNAs 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。 通過(guò)基因干擾及過(guò)表達(dá)UNC5B-AS1 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株進(jìn)行處理，再次通過(guò)RT-qPCR 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中的預(yù)測(cè)的miRNAs 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，干擾UNC5B-AS1 組miRNAs 的表達(dá)水平為（1.12±0.11），過(guò)表達(dá)UNC5B-AS1 組miRNAs 的表達(dá)水平為（0.40±0.03），對(duì)照組為（0.80±0.34），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=11.298，P=0.004）， 與對(duì)照組比較， 過(guò)表達(dá)UNC5B-AS1 組細(xì)胞中miRNAs 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），而干擾UNC5B-AS1 組細(xì)胞中miRNAs的表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

3 討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療很難依靠手術(shù)徹底摘除，以致其治療的復(fù)發(fā)率高、治愈率低[7]，神經(jīng)系統(tǒng)的檢查則有利于判斷腫瘤影響哪些腦部區(qū)域[8]。后續(xù)在宮頸癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、膠質(zhì)瘤細(xì)胞等的研究中發(fā)揮重要作用[9-10]。 lncRNA 與mRNA 之間形成的競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[11-12]。

該研究中發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中UNC5B-AS1的表達(dá)較瘤旁組織顯著降低（P＞0.05）；CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果UNC5B-AS1 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖情況無(wú)顯著影響（P＞0.05）；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果，與對(duì)照組比較， 敲除UNC5B-AS1 組膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡率明顯明顯升高， 過(guò)表達(dá)UNC5B-AS1 組膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡率明顯降低 （P＜0.05）；Transwell 檢測(cè)結(jié)果， 與對(duì)照組比較， 敲除UNC5BAS1 組膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力明顯增加， 過(guò)表達(dá)UNC5B-AS1 組膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力明顯降低（P＜0.05）。 葛維等[13]研究顯示，UNC5B-AS1 對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響，過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力。 有研究表明，lncRNA UNC5B-AS1 在卵巢癌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，下調(diào)其表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[14]，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸癌中高表達(dá)，而沉默其表達(dá)則抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、 遷移侵襲能力， 促進(jìn)其凋亡[15]。lncRNA UNC5B-AS1 在胃癌組織中含量增高，抑制其表達(dá)可以抑制胃癌AGS 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)AGS細(xì)胞的凋亡[16]。 該研究中l(wèi)ncRNA UNC5B-AS1 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖影響不是很顯著， 與上述研究結(jié)果不一致， 可能與實(shí)驗(yàn)所選取瘤細(xì)胞的分期不同， 這些數(shù)據(jù)表示明UNC5B-AS1 可作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵性因素， 并且調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移侵襲能力。

lncRNA 能夠選擇性地吸附miRNA 調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]，UNC5B-AS1 能夠負(fù)向調(diào)控miR-128-5p 的表達(dá)，促進(jìn)肺癌A549 細(xì)胞的黏附、侵襲和遷移[18]。 該研究中，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與UNC5BAS1 結(jié)合的miRNAs， 通過(guò)RT-qPCR 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中的預(yù)測(cè)的miRNAs 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)UNC5B-AS1 組細(xì)胞中miRNAs 的表達(dá)水平明顯降低 （P＜0.05）， 而干擾UNC5B-AS1 組細(xì)胞中miRNAs 的表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），由此可知，UNC5B-AS1 能夠負(fù)向調(diào)控miRNAs 的表達(dá)。 根據(jù)UNC5B-AS1 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中低表達(dá)， 以及UNC5B-AS1 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡、 遷移侵襲能力的作用， 可以推測(cè)UNC5B-AS1 可能一個(gè)抑癌基因，可以作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤診斷的標(biāo)記性因子，為臨床診斷提供理論依據(jù)。