李瑞，張文藝，應(yīng)彥祺，魯笑欽

（鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014）

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。盡管子宮內(nèi)膜癌患者總生存率相對(duì)較高，并且約50%的高危患者不會(huì)復(fù)發(fā)，但是仍有10%～15%的低?；颊邥?huì)復(fù)發(fā)［1］。腫瘤的病理分型、分級(jí)、患者的臨床因素都會(huì)影響到疾病預(yù)后。即使是同一組織類型，也會(huì)存在不同的疾病預(yù)后。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)推進(jìn)，研究者們?cè)桨l(fā)關(guān)注子宮內(nèi)膜癌在分子層面的改變。2013年基于美國(guó)癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)，子宮內(nèi)膜癌分為POLE突變型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型、低拷貝型、高拷貝型［2］?，F(xiàn)今基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)將子宮內(nèi)膜癌分類為POLE突變型、錯(cuò)配修復(fù)缺陷型、非特異型、p53突變型［3］。研究者們?cè)絹?lái)越關(guān)注子宮內(nèi)膜癌分子層面的差異，旨在進(jìn)一步對(duì)癌癥進(jìn)行分類，為患者帶來(lái)更為精準(zhǔn)且個(gè)體化的治療方案。

基因組不穩(wěn)定性（genomic instability，GI）是癌癥進(jìn)化的基礎(chǔ)，與耐藥性和預(yù)后不良有關(guān)［4］。染色體不穩(wěn)定可導(dǎo)致細(xì)胞的基因組改變，從而無(wú)限制地促進(jìn)細(xì)胞增殖［5］。DNA錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）基因在維持基因組穩(wěn)定方面起著重要作用。MMR基因突變破壞了其錯(cuò)配修復(fù)功能，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，并導(dǎo)致以林奇綜合征為代表的基因突變攜帶者患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加［6］。林奇綜合征與子宮內(nèi)膜癌的遺傳易感性相關(guān)，因?yàn)橛捎贒NA錯(cuò)配修復(fù)基因突變導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)差異，影響基因組的穩(wěn)定性［7］。

減數(shù)分裂結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶1（essential meiotic structure－specific endonuclease 1，EME1）基因?qū)τ诰S持基因組穩(wěn)定性起到重要作用，EME1缺失可導(dǎo)致DNA損傷后姐妹染色單體的交換增加［4］。有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于EME1缺失的胚胎干細(xì)胞其姐妹染色單體交換是野生型胚胎干細(xì)胞的2倍，EME1在胃癌中高表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌的分化水平和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，敲降EME1表達(dá)顯著抑制胃癌的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯［8］。在乳腺癌中，EME1高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)［9］。但是EME1目前與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系尚不明確。本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析EME1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)、與患者預(yù)后的關(guān)系及潛在作用機(jī)制，擬為深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 EME1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及預(yù)后分析使用在線工具UALCAN（http：／／ualcan.path.uab.edu／index.html）分析EME1 mRNA表達(dá)水平，該網(wǎng)站收錄了子宮內(nèi)膜癌樣本546例，正常子宮內(nèi)膜樣本35例。使用Kaplan Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／kmplot.com／analysis／）對(duì)EME1進(jìn)行生存分析，該網(wǎng)站收錄子宮內(nèi)膜癌樣本543例，依據(jù)EME1 mRNA表達(dá)水平中位值進(jìn)行分組，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，進(jìn)行總生存率（overall survival，OS）及無(wú)復(fù)發(fā)生存率（relapse－free survival，RFS）分析。

1.2 EME1相關(guān)基因使用在線工具STRING（https：／／cn.string－db.org／）進(jìn)行蛋白質(zhì)互作（proteinprotein interaction，PPI）分析，尋找與EME1蛋白緊密關(guān)聯(lián)的基因，設(shè)置物種為智人，選擇最高關(guān)聯(lián)度0.900，選取與EME1關(guān)系最為密切的前10位基因。

1.3 EME1及相關(guān)基因的富集分析使用DAVID網(wǎng)站（https：／／david.ncifcrf.gov／）對(duì)EME1及10位相關(guān)基因進(jìn)行富集分析，探索EME1及其相關(guān)基因的生物學(xué)功能。選取包含EME1的富集結(jié)果，當(dāng)P＜0.05且FDR＜0.05被認(rèn)為是顯著富集，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 EME1的甲基化水平及拷貝數(shù)使用在線工具UALCAN（http：／／ualcan.path.uab.edu／index.html）分析EME1基因啟動(dòng)子甲基化水平。使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／www.cbioportal.org／）對(duì)EME1基因進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析。

1.5 EME1潛在轉(zhuǎn)錄因子使用hTFtarget在線工具（http：／／bioinfo.life.hust.edu.cn／hTFtarget／＃?。╊A(yù) 測(cè)基因潛在的轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)合位點(diǎn)，組織限定為子宮內(nèi)膜。使用在線工具UALCAN分析轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，使用Kaplan Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行生存分析，使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／www.cbioportal.org／）對(duì)EME1與潛在轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 EME1在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)且不利預(yù)后通過(guò)在線工具UALCAN分析EMEI在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)，結(jié)果表明相較于正常子宮內(nèi)膜組織，EME1在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)（P＜0.001）（圖1A）。臨床病理分析發(fā)現(xiàn)，EME1的表達(dá)與腫瘤分期無(wú)關(guān)（圖1B），與腫瘤病理分型有關(guān)（圖1C）。EME1在漿液性癌（P＜0.001）及混合型癌（P＝0.044）中的表達(dá)水平高于子宮內(nèi)膜樣癌。通過(guò)Kaplan－Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)繪制EME1生存曲線，發(fā)現(xiàn)EME1與子宮內(nèi)膜癌患者總生存率（圖2A）及無(wú)復(fù)發(fā)生存率（圖2B）相關(guān)，可作為潛在的不良預(yù)后因子。EME1表達(dá)水平越低，患者總生存率（P＝0.001）及無(wú)復(fù)發(fā)生存率（P＝0.018）越高。

圖1 EME1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況

圖2 EME1與子宮內(nèi)膜癌患者生存率關(guān)系

2.2 EME1及其相關(guān)基因EME1基因可以翻譯成蛋白質(zhì)行使生物學(xué)功能。因此，通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)EME1進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析查找最密切相關(guān)的前10位蛋白，其基因名分別為BRCA1、TOP3A、RAD51、SLX4、ERCC4、MUS81、EXO1、RMI1、RMI2、BLM（圖3）。對(duì)EME1及10位相關(guān)基因共同進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因集中在“核質(zhì)”“霍利迪連接體解離酶復(fù)合物”等細(xì)胞組分，涉及“DNA結(jié)合”“脫氧核糖核酸內(nèi)切酶”等分子功能，“DNA修飾”“鏈間交聯(lián)損傷修復(fù)”等生物過(guò)程，“范可尼貧血途徑”“同源重組”等信號(hào)通路（表1）。

表1 EME1的GO和KEGG富集分析

圖3 EME1密切相關(guān)的10個(gè)蛋白

2.3 EME1機(jī)制探索為了進(jìn)一步探索子宮內(nèi)膜癌中EME1高表達(dá)的潛在機(jī)制，使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)EME1基因啟動(dòng)子甲基化分析，發(fā)現(xiàn)正常子宮內(nèi)膜與子宮內(nèi)膜癌的甲基化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.160）（圖4A）。但是通過(guò)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌患者中，當(dāng)EME1基因拷貝數(shù)值越大，EME1 mRNA表達(dá)量越高（r＝0.260，P＜0.001）（圖4B）。

圖4 EME1基因表達(dá)狀態(tài)

使用hTFtarget預(yù)測(cè)EME1潛在轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子ESR1。ESR1蛋白與EME1 DNA序列存在潛在結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于17號(hào)染色體，范圍50 372 893～50 373 256，峰位于啟動(dòng)子區(qū)域，峰富集分?jǐn)?shù)為17.4，距離EME1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游327堿基對(duì)（圖5）。通過(guò)UALCAN表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，ESR1在子宮內(nèi)膜癌中低表達(dá)（P＜0.001）（圖6A）。對(duì)ESR1進(jìn)行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，ESR1高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者總生存率高相關(guān)（P＜0.001）（圖6B），與無(wú)復(fù)發(fā)生存率高相關(guān)（P＝0.031）（圖6C）。使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)EME1與ESR1進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ESR1 mRNA與EME1 mRNA二者在子宮內(nèi)膜癌中呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r＝－0.280，P＜0.001）（圖6D）。

圖5 EME1潛在轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

圖6 ESR1 mRNA表達(dá)水平、對(duì)生存率的影響及其與EME1 mRNA表達(dá)水平的關(guān)系

3 討論

EME1位于17q21.33（第17號(hào)染色減數(shù)分裂結(jié)構(gòu)體長(zhǎng)臂2區(qū)1帶3亞帶3次亞帶），可編碼蛋白質(zhì)。EME1蛋白可以與特定的DNA結(jié)構(gòu)相互作用，例如霍利迪連接體、3’末端翹翼（3’flap）結(jié)構(gòu)、異常復(fù)制叉結(jié)構(gòu)［10－11］，該蛋白可能影響DNA損傷修復(fù)并保持基因組穩(wěn)定性［4］。Weinandy等［12］發(fā)現(xiàn)原發(fā)性人膠質(zhì)細(xì)胞瘤中西妥昔單抗可以通過(guò)提高EME1的表達(dá)水平促進(jìn)DNA修復(fù)，進(jìn)而達(dá)到抗癌效用。EME1自身外顯子突變影響體內(nèi)EME1表達(dá)水平，中國(guó)南方女性的EME1 Ile350Thr變異與乳腺癌的易感性和早發(fā)顯著相關(guān)，其過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致乳腺癌的順鉑耐藥［13］。然而，目前EME1在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制目前尚不明確。本研究利用生物信息學(xué)探索EME1與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性，為未來(lái)的機(jī)制探索提供研究基礎(chǔ)。

Tomoda等［14］對(duì)多種癌細(xì)胞株檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，EME1低表達(dá)的腫瘤對(duì)化療藥敏感性更強(qiáng)，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株AN3CA中EME1是高表達(dá)，但是并未檢測(cè)人子宮內(nèi)膜癌組織中EME1的表達(dá)狀況。UALCAN網(wǎng)站匯集了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)546例人子宮內(nèi)膜癌和35例人正常子宮內(nèi)膜樣本的mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，經(jīng)生物信息分析發(fā)現(xiàn)EME1 mRNA在子宮內(nèi)膜癌患者中高表達(dá)，其中漿液性子宮內(nèi)膜癌與混合型子宮內(nèi)膜癌中EME1 mRNA的表達(dá)水平高于子宮內(nèi)膜樣癌。進(jìn)行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，EME1基因高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌不良預(yù)后相關(guān)。利用蛋白質(zhì)相互作用原理，尋找與EME1蛋白關(guān)系最為密切的10個(gè)蛋白，進(jìn)行富集分析。10個(gè)蛋白分別是BRCA1、TOP3A、RAD51、SLX4、ERCC4、MUS81、EXO1、RMI1、RMI2、BLM。BRCA1是一種同源重組修復(fù)蛋白，維持染色體穩(wěn)定性。Nahshon等［15］研究發(fā)現(xiàn)在BRCA1／2突變的人群中子宮內(nèi)膜癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加2～3倍，子宮內(nèi)膜漿液性癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加12～13倍。BLM－TOP3A－RMI1／2溶解酶復(fù)合物與端粒延長(zhǎng)替代通路中C環(huán)形成有關(guān)［16］。子宮內(nèi)膜癌患者BLM Ash雜合突變率高于正常人群［17］。EME1蛋白可以與MUS81蛋白組合成異源二聚體，發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性［18］。RAD51可抑制MUS81－EME1對(duì)DNA 3’末端翹翼的切割作用［19］。RAD51在各種腫瘤中過(guò)表達(dá)導(dǎo)致錯(cuò)誤的DNA雙鏈修復(fù)，可促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移。RAD51基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)［20］。SLX4蛋白是用于組裝SLX1－SLX4－MUS81－EME1－XPF－ERCC1（SMX）三核酸酶復(fù)合物的支架，SMX促進(jìn)DNA 同源重組修復(fù)［21］。SLX4也可與XPFERCC4核酸內(nèi)切酶復(fù)合體的亞基結(jié)合，奠定DNA鏈間交聯(lián)損傷修復(fù)的基礎(chǔ)［22］。EXO1是一種DNA核酸外切酶，與雙鏈斷裂修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)、端粒維持有關(guān)［23］。富集分析結(jié)果顯示它們主要涉及霍利迪連接體、DNA修復(fù)、范可尼貧血途徑等。富集分析的結(jié)果與EME1現(xiàn)有研究所揭露的功能是相符的。上述分析結(jié)果可為探索子宮內(nèi)膜癌中EME1的作用機(jī)制鋪墊基礎(chǔ)。

利用生物信息技術(shù)對(duì)EME1作用機(jī)制進(jìn)行上游追溯，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞基因拷貝數(shù)增加與EME1高表達(dá)水平相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)EME1啟動(dòng)子的潛在轉(zhuǎn)錄因子ESR1。ESR1可編碼雌激素受體α，經(jīng)生物信息分析發(fā)現(xiàn)，ESR1在子宮內(nèi)膜癌中低表達(dá)，與EME1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)現(xiàn)有分析結(jié)果進(jìn)行推測(cè)：（1）高表達(dá)的ESR1可能對(duì)EME1啟動(dòng)子有負(fù)性調(diào)控作用，抑制EME1的表達(dá)，當(dāng)ESR1低表達(dá)時(shí)，對(duì)EME1的抑制減少；（2）生物信息分析結(jié)果基于現(xiàn)有研究，具有一定的局限性，可能ESR1與其他轉(zhuǎn)錄因子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，進(jìn)而抑制EME1的表達(dá)。未來(lái)可以借助染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)探索EME1的潛在轉(zhuǎn)錄因子。

綜上所述，圍繞EME1進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，挖掘了10個(gè)相關(guān)基因，1個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄因子，為接下來(lái)EME1具體作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)也肯定了EME1與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性、重要性，展現(xiàn)了繼續(xù)深入研究的價(jià)值，為未來(lái)子宮內(nèi)膜癌患者的精準(zhǔn)治療提供研究基礎(chǔ)。