閻赟夢(mèng)，葉亞菲，毛紅麗

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052）

肝細(xì)胞癌是原發(fā)性肝癌中最常見(jiàn)的亞型［1］。在全球范圍內(nèi)，肝癌在癌癥相關(guān)死亡的最常見(jiàn)原因中排名第四，在發(fā)病病例中排名第六。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的年度預(yù)測(cè)，到2030年，估計(jì)將有100多萬(wàn)人死于肝癌［2］。肝癌的5 a存活率為18%，是僅次于胰腺癌的第二大惡性腫瘤［3］。肝癌多發(fā)生于肝硬化患者。由于存在局部晚期和轉(zhuǎn)移性疾病，許多肝癌患者錯(cuò)失手術(shù)切除治療的良機(jī)。大多數(shù)肝癌的基因組、表觀遺傳學(xué)和代謝水平都極其復(fù)雜，很難找到有效的治療方案，而且其化療治療進(jìn)展也非常緩慢［4－5］。因此，探討肝癌發(fā)生的關(guān)鍵促癌分子機(jī)制將有助于確定特異性的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，并為患者分層和治療指導(dǎo)提供新的視角［6］。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non－coding RNAs，lncRNAs）是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非蛋白編碼RNA，在腫瘤中起著重要的調(diào)節(jié)作用［7－8］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［9］。小核仁RNA宿主基因20（small nucleolar RNA host gene 20，SNHG20）被認(rèn)為是許多人類腫瘤潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物，并與多種腫瘤臨床病理特征密切相關(guān)［10］。本研究旨在探討SNHG20在肝癌中的綜合作用，并強(qiáng)調(diào)其與免疫的關(guān)系，以期為肝癌提供一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中分析374個(gè)肝癌組織樣本信息，該數(shù)據(jù)庫(kù)包含肝癌患者的臨床信息和基因表達(dá)譜。排除總生存時(shí)間數(shù)據(jù)缺失或不足的病例，納入所有既有表達(dá)又有臨床信息的樣本。根據(jù)SNHG20表達(dá)的中位數(shù)將肝癌患者分為SNHG20高表達(dá)（187例）和低表達(dá)（187例）。

1.2 生存與表達(dá)分析采用R語(yǔ)言研究SNHG20在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系并評(píng)價(jià)SNHG20對(duì)肝癌患者預(yù)后的影響。用Boxplots分析SNHG20在不同組間的差異表達(dá)。

1.3 肝癌組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平為了計(jì)算SNHG20表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的相關(guān)性，采用R分析［11］。用Pearson相關(guān)分析判斷腫瘤純度和SNHG20表達(dá)之間的關(guān)系。通過(guò)Spearman相關(guān)分析，計(jì)算了6種不同類型免疫細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)程度與SNHG20表達(dá)水平之間的關(guān)系［12］。

1.4 基因集富集分析采用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）4.0.3軟件進(jìn)行富集分析，將SNHG20的高、低表達(dá)水平歸類為表型文件，所有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均作為表達(dá)數(shù)據(jù)文庫(kù)，替換試驗(yàn)次數(shù)為1 000次。富集結(jié)果使用歸一化富集得分＞1.5作為顯著富集的篩選標(biāo)準(zhǔn)［13］。

1.5 CIBERSORT法檢測(cè)腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞在肝癌中的免疫應(yīng)答CIBERSORT（http：／／cibersort.Stanford.edu／）可以計(jì)算腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的豐度。使用CIBERSORT對(duì)肝癌中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答進(jìn)行量化，以評(píng)估其與SNHG20表達(dá)水平和存活率的關(guān)系［14］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用R 3.6.3軟件包進(jìn)行整合和結(jié)構(gòu)化。對(duì)SNHG20表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。此外，單因素和多因素Cox分析揭示研究人群中的獨(dú)立預(yù)后變量。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG20在肝癌中表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，相比于癌旁組織，SNHG20在肝癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)。見(jiàn)圖1A。SNHG20的高表達(dá)與T分期、病理分期、腫瘤狀態(tài)、體質(zhì)量、血管侵犯和總生存期有相關(guān)性（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 SNHG20在肝癌組織和癌旁組織中的差異表達(dá)

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的肝癌患者臨床病理參數(shù)和SNHG20表達(dá)之間的關(guān)系［n（%）］

表1（續(xù)）

2.2 SNHG20表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系進(jìn)一步生存分析結(jié)果顯示：與SNHG20低表達(dá)的肝癌患者比較，SNHG20高表達(dá)組肝癌患者的總體生存時(shí)間、疾病特異性生存期、無(wú)復(fù)發(fā)生存期時(shí)間縮短。見(jiàn)圖2A、B、C。

圖2 SNHG20表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系

2.3 單因素和多因素Cox回歸分析將患者年齡、性別、SNHG20表達(dá)水平、病理分級(jí)、TNM 分期納入Cox模型進(jìn)行單因素及多因素分析。結(jié)果顯示，在單因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析中，SNHG20高表達(dá)是肝癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素（風(fēng)險(xiǎn)比率＝1.662，P＝0.004）。見(jiàn)表2。為了排除其他臨床病理的干擾，進(jìn)行了多因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析。結(jié)果提示，SNHG20高表達(dá)、TNM分期是影響肝癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其風(fēng)險(xiǎn)比率分別為1.591和1.788。見(jiàn)表3。

表2 SNHG20表達(dá)與肝癌患者臨床病理因素的單因素Cox分析

表3 SNHG20表達(dá)與肝癌患者臨床病理因素的多因素Cox分析

2.4 SNHG20表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的關(guān)系腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞水平被認(rèn)為是影響癌癥患者生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。圖3顯示了22個(gè)免疫細(xì)胞亞群的比例在SNHG20高低表達(dá)的分布情況，其中T細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、CD56dim自然殺傷細(xì)胞、CD56bright自然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、并指狀細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、細(xì)胞毒細(xì)胞、B細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、Tgd細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Th2細(xì)胞及調(diào)節(jié)下T細(xì)胞在SNHG20高低表達(dá)的富集得分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 22種免疫細(xì)胞亞群的比例在肝癌組織SNHG20高低表達(dá)的分布情況

2.5 肝癌組織中SNHG20的表達(dá)與免疫浸潤(rùn)程度之間的關(guān)系圖4表明SNHG20表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性。肝癌組織中SNHG20的表達(dá)水平與細(xì)胞毒細(xì)胞（r＝－0.290，P＜0.001）（圖5A）、樹(shù)突狀細(xì)胞（r＝－0.320，P＜0.001）（圖5B）、中性粒細(xì)胞（r＝－0.370，P＜0.001）（圖5C）與自然殺傷細(xì)胞（r＝－0.250，P＜0.001）浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)（圖5D）。

圖4 SNHG20表達(dá)與免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)性

圖5 肝癌組織中的SNHG20表達(dá)與細(xì)胞的相關(guān)性

2.6 SNHG20差異表達(dá)富集的基因集基因富集分析結(jié)果顯示高SNHG20表達(dá)富集KEGG DNA復(fù)制、KEGG細(xì)胞周期信號(hào)通路、KEGG Wnt信號(hào)通路。低SNHG20表達(dá)具有KEGG胰島素信號(hào)通路的富集。

圖6 SNHG20差異表達(dá)基因的GSEA分析

3 討論

SNHG20在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，SNHG20抑制劑可以作為抗癌治療的候選藥物［15］。然而，SNHG20在肝細(xì)胞癌中的潛在預(yù)測(cè)作用的信息很少。本研究通過(guò)分析SNHG20在肝癌組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步對(duì)SNHG20在肝癌中的可能作用進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，SNHG20的表達(dá)水平與肝癌患者的T分期、病理分期、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤狀態(tài)和血管侵犯有關(guān)。SNHG20的高表達(dá)與肝細(xì)胞癌預(yù)后不良有關(guān)。

多因素Cox回歸分析表明SNHG20高水平表達(dá)是肝癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。在肝細(xì)胞癌中，SNHG20的表達(dá)與免疫浸潤(rùn)水平之間存在顯著聯(lián)系。CIBERSORT研究表明，SNHG20的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的免疫浸潤(rùn)程度有關(guān)。肝癌組織中SNHG20的表達(dá)與B細(xì)胞、T細(xì)胞、細(xì)胞毒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的浸潤(rùn)程度呈負(fù)相關(guān)。此外，幾種免疫細(xì)胞基因標(biāo)志物的表達(dá)與SNHG20的相關(guān)性提示SNHG20在肝癌的腫瘤免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)中具有重要作用。所有這些結(jié)果都表明SNHG20高水平表達(dá)與免疫力下降之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。

通常，關(guān)于TIICs效應(yīng)的證據(jù)主要集中在人類腫瘤中的T細(xì)胞上［16－17］。越來(lái)越多的研究表明T細(xì)胞水平總數(shù)升高是腫瘤患者有利的預(yù)后因素之一［18］。此外，B細(xì)胞可以影響卵巢癌和乳腺癌的總體存活率［19］。先前的一項(xiàng)研究表明，B細(xì)胞、T細(xì)胞的基因表達(dá)以及BCR片段之間存在極高的相關(guān)性［20－21］。免疫信號(hào)在免疫細(xì)胞類型之間存在著很強(qiáng)的相關(guān)性，這表明腫瘤免疫浸潤(rùn)是多樣性、一致性和可預(yù)測(cè)性［22－23］。因此，SNHG20對(duì)肝癌的作用可能與B細(xì)胞和T細(xì)胞的濃度有關(guān)。

GSEA分析表明，在SNHG20高表達(dá)表型中，KEGG DNA復(fù)制、KEGG細(xì)胞周期和KEGG Wnt信號(hào)通路顯著富集。而在SNHG20低表達(dá)表型中，KEGG胰島素信號(hào)通路明顯富集。所有這些結(jié)果都表明SNHG20可能被用作肝癌的預(yù)測(cè)和治療靶點(diǎn)。研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了SNHG20與肝細(xì)胞癌的免疫浸潤(rùn)和預(yù)后之間的聯(lián)系。分析結(jié)果表明，SNHG20對(duì)肝細(xì)胞癌中的細(xì)胞毒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)有顯著影響。細(xì)胞毒細(xì)胞（r＝－0.290，P＜0.001）、樹(shù)突狀細(xì)胞（r＝－0.320，P＜0.001）、中性粒細(xì)胞（r＝－0.370，P＜0.001）、NK細(xì)胞（r＝－0.250，P＜0.001）與SNHG20表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。

SNHG20是一種不編碼蛋白質(zhì)的RNA。既往研究結(jié)果表明，SNHG20在肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［10，24－26］。但SNHG20介導(dǎo)肝癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不清楚。Zhang等［27］表明，SNHG20過(guò)表達(dá)導(dǎo)致肝癌的不良預(yù)后，在肝細(xì)胞癌的發(fā)展中發(fā)揮了作用，與本研究分析結(jié)果一致。因此，有理由相信SNHG20將影響肝細(xì)胞癌的病理生理機(jī)制的發(fā)展，基于研究結(jié)果和先前的SNHG20研究，但目前還不能全面地解釋SNHG20與肝細(xì)胞癌免疫浸潤(rùn)之間的關(guān)系。

綜上，SNHG20是肝細(xì)胞癌預(yù)后分子標(biāo)志物。SNHG20可能調(diào)控的肝癌關(guān)鍵通路包括KEGG胰島素通路、KEGG Wnt信號(hào)通路、KEGG細(xì)胞周期和KEGG DNA復(fù)制信號(hào)通路。進(jìn)一步的研究表明，肝癌組織中SNHG20的表達(dá)與B細(xì)胞、T細(xì)胞、細(xì)胞毒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的浸潤(rùn)程度呈顯著負(fù)相關(guān)，SNHG20在肝癌的腫瘤免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)中具有重要作用。關(guān)于SNHG20影響肝癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。