姚迪，常紅巖，王琳

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 信息處，河南 鄭州 450052）

醫(yī)學(xué)的進(jìn)步是醫(yī)學(xué)研究者不懈努力所獲得的結(jié)果，但是從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)到臨床應(yīng)用是一個(gè)漫長的過程，期間根據(jù)某種現(xiàn)象到提出假說，再通過一系列摸索得出適應(yīng)人體水平的結(jié)果，往往帶有極大風(fēng)險(xiǎn)及花費(fèi)。所以找到一種方法能夠簡化其中步驟是有必要的。進(jìn)入新世紀(jì)，生物信息學(xué)從提出到實(shí)踐逐漸成熟，它將信息技術(shù)與生命科學(xué)相結(jié)合，成為研究方法的一種熱點(diǎn)。利用計(jì)算機(jī)技術(shù)及生物信息技術(shù)，對于目前研究發(fā)現(xiàn)結(jié)果進(jìn)行分析，進(jìn)而對實(shí)驗(yàn)假想進(jìn)行探索及驗(yàn)證，是可以利用的方法［1］。食管癌是最常見的癌癥之一，在全世界所有癌癥中病死率排名第六［2］。食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）為主要組織學(xué)類型，在中國非常普遍［3］。由于晚期發(fā)病所致和轉(zhuǎn)移傾向，盡管最近在診斷和治療后ESCC的預(yù)后仍不滿意，年生存率僅為15% ～25%［4］。白細(xì)胞介素－17（interleukinIL－17，IL－17）是一種主要由Th17輔助細(xì)胞分泌的炎癥細(xì)胞因子，并且一些研究顯示IL－17在多種腫瘤中發(fā)揮了重要作用［5］，但關(guān)于IL－17在ESCC內(nèi)對腫瘤作用的研究較少，并且仍有爭議［6－7］。目前基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus database，GEO）是當(dāng)今最大、最全面的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)資源，包含了43個(gè)腫瘤項(xiàng)目及68種腫瘤類型，其中含有大量的微陣列芯片和測序數(shù)據(jù)［8］。本研究基于數(shù)據(jù)庫研究IL－17在食管鱗癌的表達(dá)及其相關(guān)通路蛋白的表達(dá)情況，并基于現(xiàn)實(shí)世界中食管鱗癌相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索策略檢索PubMed數(shù)據(jù)庫獲取食管癌相關(guān)文獻(xiàn)，檢索起止日期為2000年1月1日至2021年11月21日。檢索策略主要是Esophageal squamous cell carcinoma和IL－17，采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，統(tǒng)計(jì)研究數(shù)據(jù)，包括發(fā)表時(shí)間和研究細(xì)胞因子，獲得目前關(guān)于研究情況，獲取熱點(diǎn)研究因子，為下一步統(tǒng)計(jì)分析做指導(dǎo)。

1.2 數(shù)據(jù)收集和預(yù)處理本研究樣本選取標(biāo)準(zhǔn)為于2021年1月從GEO數(shù)據(jù)庫（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／）中下載食管鱗癌組織樣本數(shù)據(jù)集GSE26886（包含69例食管組織）的芯片原始數(shù)據(jù)。分析其中相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況。在RStudio 4.0中用Affy包讀取原始文件，使用RMA算法預(yù)處理得到標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，再對兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行注釋，log2轉(zhuǎn)化，R包SVA校正批次效應(yīng)并合并。

1.3 食管組織病理學(xué)檢查

1.3.1 免疫組化檢測IL－17表達(dá) 將組織玻片依次放入二甲苯，體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇，1×PBS洗3次，每次5 min。提前將抗原修復(fù)液在微波爐中煮沸，煮沸后將載玻片放入抗原修復(fù)液中，使抗原充分暴露。自然冷卻至室溫。1×PBS中洗3次，每次5 min。取20 mL體積分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫、180 mL甲醇混勻，將載玻片放入體積分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫－甲醇溶液中，浸泡20 min。1×PBS洗3次，每次5 min。用1×PBS配置體積分?jǐn)?shù)為5%的山羊血清，用免疫組化筆將組織圈起來，將配好的山羊血清直接加到組織上，以剛好在圈內(nèi)覆蓋組織為宜，孵育10～30 min。用1∶50的一抗加到組織芯片上覆蓋住組織，孵育過夜。1×PBS中洗3次，每次5 min。按體積比為1∶100的比例用1×PBS配置二抗，將二抗加到組織芯片上覆蓋住組織。孵育5 h。向組織芯片上加DAB，進(jìn)行染色，將組織芯片放入蘇木素中染色。將組織芯片放平，在組織上滴加中性樹膠，盡可能覆蓋組織，蓋上蓋玻片，注封片。

1.3.2 蛋白質(zhì)免疫印跡（western blot，WB）檢測細(xì)胞因子表達(dá) 裂解組織，提取蛋白；應(yīng)用BCA法測定蛋白含量；根據(jù)蛋白大小配制濃縮膠和合適濃度的分離膠及濃縮膠，毎孔加30μg已變性的蛋白樣品，80 V電泳至分離膠后改為120 V電泳，約50 min終止電泳，按白扳、海綿、濾紙、PVDF膜、PAGE膠片、濾紙、海綿、黑板順序放置，放置時(shí)保證去除氣泡使PVDF膜與電泳凝膠充分貼合，蛋白轉(zhuǎn)膜；隨后將NC膜放入50 g·L－1脫脂奶粉封閉液中封閉2 h，然后進(jìn)行一抗及二抗孵育，隨后進(jìn)行ECL顯色。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果通過文獻(xiàn)檢索共獲得56篇文獻(xiàn)，經(jīng)反復(fù)閱讀文獻(xiàn)內(nèi)容，排除重復(fù)研究、會議摘要、編者按、勘誤、信件等40篇，排除相關(guān)文獻(xiàn)中不包含缺失研究因子，或者研究通路不明確的文獻(xiàn)，最終納入15篇進(jìn)行分析。其中2000—2010之間有1篇文獻(xiàn)發(fā)表，2010—2021年有14篇文獻(xiàn)發(fā)表。統(tǒng)計(jì)其中研究的細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素－6（interleukin－6，IL－6）、S100鈣結(jié)合蛋白A8（recombinant S100 calcium binding protein A8，S100A8）、S100鈣結(jié)合蛋白A9（recombinant S100 calcium binding protein A9，S100A9）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP－9）、基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metallopeptidase 13，MMP－13）等各細(xì)胞因子研究熱度，以及各細(xì)胞因子在腫瘤組織中相比正常組織中的對比值，并定義其為表達(dá)量，結(jié)果顯示：其中IL－6、S100A9及MMP－9研究熱度較高；MMP－9在腫瘤組織中表達(dá)量高；而S100A9在腫瘤組織中表達(dá)量低。見圖1。

圖1 各細(xì)胞因子研究熱度

2.2 從GEO數(shù)據(jù)庫中下載食管鱗癌組織樣本數(shù)據(jù)集GSE26886GSE數(shù)據(jù)集中包含28例食管標(biāo)本，其中10例食管鱗癌及18例正常標(biāo)本基因集，食管鱗癌與正常組織標(biāo)本非成對標(biāo)本，僅僅提供腫瘤組織臨床數(shù)據(jù)。其中男女分別為8例及2例；中位年齡為58.2歲；分化程度為中分化5例，高分化5例；其中T1病變?yōu)?例，T3病變?yōu)?例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為7例，未轉(zhuǎn)移為3例。選取其中鱗癌樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示腫瘤組織中IL－17、IL－6、MMP－9、MMP－13的基因表達(dá)量均高于正常組織，S100A8在正常與腫瘤組織中表達(dá)差異不明顯，但是腫瘤組織中S100A9表達(dá)量低于正常組織。見圖2。

圖2 食管鱗癌數(shù)據(jù)集GSE26886中顯示腫瘤組織中IL－17、IL－6、S100A8、S100A9、MMP－9、MMP－13表達(dá)情況

2.3 蛋白檢測

2.3.1 食管鱗癌組織免疫組化 利用12例T3N0M0食管鱗癌標(biāo)本行免疫組化檢測。其中男6例，女6例；中位年齡為54歲；高分化5例，中分化7例；所有患者腫瘤病變?yōu)門3；淋巴結(jié)均未轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示腫瘤組織中IL－17表達(dá)量（66.30±17.14）較正常組織（22.53±5.13）表達(dá)量增加（P＜0.05）；在高分化腫瘤中表達(dá)量（60.53±3.96）高于正常組織中（23.5±3.28）表達(dá)量（P＜0.05）；中分化腫瘤中表達(dá)量（76.17±4.73）高于正常組織中（76.17±4.73）表達(dá)量（P＜0.05）。

2.3.2 WB 根據(jù)發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)的關(guān)于IL－17的研究結(jié)果，選取研究熱度較高的細(xì)胞因子進(jìn)行組織蛋白檢測；選取IL－17上游細(xì)胞因子IL－6及下游細(xì)胞因子MMP－9、S100A9行WB檢測，蛋白結(jié)果顯示MMP－9。IL－6在腫瘤組織標(biāo)本中表達(dá)量高于正常組織，S100A9腫瘤組織中表達(dá)量低于正常組織，與基因芯片中獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果類似。見圖3。

圖3 組織中各因子WB表達(dá)情況

3 討論

上世紀(jì)80年代美國科學(xué)家在科學(xué)雜志上首次提出檢測人類基因組［9］，因?yàn)閿?shù)據(jù)龐大，為解決這個(gè)問題，逐漸興起了一門新興的科學(xué)即生物信息學(xué)，它的出現(xiàn)，不僅使人們對生物體和生物信息的起源有了新的認(rèn)識，而且也為人類疾病的診治開辟了全新的途徑。所以這門學(xué)科能夠使信息工作者和臨床科技人員緊密聯(lián)系起來。目前有很多的大型生物學(xué)數(shù)據(jù)庫都是公開的，包含了眾多的生物學(xué)資源，可以使人們更方便地獲取想要的資料，例如TCGA、GEO等數(shù)據(jù)庫。一些研究結(jié)果顯示可以利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫獲得一些結(jié)果［10－11］。但是這些結(jié)果只是篩選可能有用基因，并未在組織標(biāo)本中驗(yàn)證。本研究是與臨床醫(yī)生合作，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)及生物信息技術(shù)驗(yàn)證理論猜想。

河南省林州為食管癌高發(fā)區(qū)，雖然經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的努力，但是目前食管癌患者治療后的生存情況仍不夠理想［4，12］。為了改善患者預(yù)后，探索新的治療模式。而目前IL－17在許多研究中顯示其對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到一定作用［13］，遂以此為方向，研究IL－17在食管鱗癌中的作用。首先建立理論依據(jù)，根據(jù)發(fā)表的文獻(xiàn)，獲得研究方向；查閱大量文獻(xiàn)，目前使用最多的就是美國的國家生物技術(shù)信息中心包含的PubMed功能，在上面可查詢成千上萬篇的文獻(xiàn)和文摘，并且可以得到近500種期刊發(fā)表的文章全文［14］。本研究首先以esophageal squamous cell carcinoma和IL－17為關(guān)鍵詞，在PubMed上進(jìn)行檢索，排除不符合標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)。在對符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)進(jìn)行仔細(xì)閱讀分析后，發(fā)現(xiàn)IL－17在食管癌組織中是有可能升高的，而其相關(guān)的一些細(xì)胞因子在腫瘤組織中表達(dá)各有不同。

獲得需要研究的相關(guān)細(xì)胞因子后，在GEO中檢索出GSE26886提供的臨床資料及基因數(shù)據(jù)類型符合研究所需。GEO是一個(gè)巨大的基因數(shù)據(jù)庫，包含了100多種生物體的超過10億個(gè)單獨(dú)的基因數(shù)據(jù)［15］。雖然GEO可以提供簡單的數(shù)據(jù)分析，但是卻不能進(jìn)行復(fù)雜的分析。檢索的基因數(shù)據(jù)表達(dá)譜采用的是Affy芯片，使用RStudio提取基因數(shù)據(jù)，獲取基因探針，對比正常組織及腫瘤組織中相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)量，獲得了與文獻(xiàn)類似的結(jié)果。一些研究結(jié)果顯示可以利用GEO獲取相關(guān)細(xì)胞因子［11，16］。

本研究進(jìn)一步提供證據(jù)表明，食管癌患者中IL－17在腫瘤分泌量較正常組織高，而且研究結(jié)果顯示隨著腫瘤發(fā)展，IL－17在腫瘤組織中的表達(dá)量較正常組織高，這與以前的一篇研究結(jié)果［17］類似，可以提示IL－17可能促進(jìn)腫瘤生長。一些研究表明某些上游細(xì)胞因子（IL－6）參與了Th17細(xì)胞的分化和發(fā)育，進(jìn)而影響IL－17分泌及相關(guān)通路的表達(dá)［18－21］。IL－6對IL－17的影響主要體現(xiàn)在其可以調(diào)節(jié)產(chǎn)生IL－17的Th17細(xì)胞，IL－6誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞與TGF－β共同刺激Th17細(xì)胞的發(fā)育［22－23］。本研究中也發(fā)現(xiàn)IL－6在腫瘤組織中有所升高，顯示其間可能有相關(guān)性。S100A8／A9是由S100A8與S100A9蛋白結(jié)合形成的異二聚體，通過與不同的金屬離子及細(xì)胞作用調(diào)節(jié)炎癥狀態(tài)，抑制細(xì)菌增殖，促使細(xì)胞骨架重排?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類廣泛存在于血管壁細(xì)胞外基質(zhì)的鋅離子依賴性水解酶，與細(xì)胞外基質(zhì)破壞和重建以及動脈粥樣硬化、腦梗死、腦出血、腫瘤等疾病密切相關(guān)。一些研究顯示S100A8、MMP－9及MMP－13在食管癌組織中表達(dá)量增高且可能與IL－17相關(guān)［24－26］，在本研究中獲得類似結(jié)果。本研究顯示腫瘤組織中S100A9的表達(dá)量低于正常組織，顯示S100A9可能與IL－17的分泌成負(fù)相關(guān)，與以前的研究結(jié)果［27］相似。

綜上所述，本研究通過對GEO食管癌芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，顯示IL－17在食管癌腫瘤組織中表達(dá)量高于正常組織，而與其分泌相關(guān)的IL－6在腫瘤組織中表達(dá)量高于正常組織，而IL－17影響的MMP－9等因子在腫瘤組織中也高于正常組織，且在組織標(biāo)本中已經(jīng)進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。這顯示了生物信息學(xué)分析工具在挖掘腫瘤發(fā)生機(jī)制、療效評價(jià)及預(yù)后預(yù)測方面的巨大應(yīng)用價(jià)值，相信結(jié)合后續(xù)分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究，可以為其他疾病的診斷與治療提供新的思路。