陳媛媛 唐艷 李玲

胃癌(gastric cancer，GC)是世界第五大最常見的癌癥，也是全球第三大癌癥死亡原因，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]。因此，研究胃癌診斷、預(yù)后和藥物治療的靶點(diǎn)具有重要的醫(yī)學(xué)意義。越來越多的證據(jù)表明，非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)在胃腸道惡性腫瘤中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。近年來，研究人員利用高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了大量的環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNAs)，并證實(shí)其參與胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移侵襲[2]。近期有研究報(bào)道，新發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA SH3結(jié)構(gòu)域激酶結(jié)合蛋白1(circular RNA SH3 binding protein 1，CircSHKBP1)在胃癌患者組織和血清中的表達(dá)均異常上調(diào)，并且與胃癌的惡性進(jìn)展有關(guān)[3]，但是CircSHKBP1發(fā)揮促進(jìn)癌癥惡化的機(jī)制尚未清楚。大量研究證實(shí)，circRNA通過吸附miRNAs的方式發(fā)揮癌癥發(fā)展中的調(diào)控蛋白翻譯功能[4]。miR-1294在多種癌癥中表達(dá)異常下調(diào)，發(fā)揮抑制癌癥惡化的作用，其中包括胃癌[5,6]。但是，CircSHKBP1在胃癌中的調(diào)控作用是否與miR-1294相關(guān)聯(lián)，有待進(jìn)一步研究。本研究擬以胃癌細(xì)胞為研究對象，觀察過表達(dá)CircSHKBP1對胃癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響，旨在揭示其作用機(jī)制與CircSHKBP1靶向miR-1294有關(guān)，為胃癌的診斷、治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)所用組織標(biāo)本收集于2019年3月至2021年2月，本醫(yī)院確診并行外科手術(shù)切除的胃癌標(biāo)本及其正常組織40例，其中處理T1～T2級的有12例，T3～T4級的有28例。涉及的患者及其家屬全部簽署知情同意書。本試驗(yàn)跟蹤回訪調(diào)查本醫(yī)院確診的90例胃癌患者的5年生存期。正常胃上皮細(xì)胞GES1、胃癌細(xì)胞MGC803、HGC27、BGC823均購自上海中國科學(xué)研究院細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自北京康為世紀(jì)；胎牛血清購自杭州四季青；CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所；胰蛋白酶均購自美國Sellect公司；LipofectamineTM3000購自大連TaKaRa公司；熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素和碘化丙錠細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V/FITC)購自北京索萊寶公司；ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國ABI公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織樣本的處理:取出冰凍保存的組織，緩慢融化，無菌研磨，用2倍組織體積的無菌蒸餾水稀釋研磨，最后保存?zhèn)溆?。將癌旁的正常胃組織標(biāo)記為正常胃組織組，T1～T2級癌組織標(biāo)記為T1～T2組，T3～T4級癌組織標(biāo)記為T3～T4組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組:將GES1、MGC803、HGC27、BGC823在培養(yǎng)的時(shí)候使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(混有10%胎牛血清)。培養(yǎng)溫度為37℃，所用氣體為5%CO2，95%O2，隔天換液。將培養(yǎng)48 h的這些細(xì)胞分別標(biāo)記為GES1組、MGC803組、HGC27組、BGC823組。將pcDNA、pcDNA-CircSHKBP1、miR-NC、miR-1294、pcDNA-CircSHKBP1+miR-NC、pcDNA-CircSHKBP1+miR-1294用脂質(zhì)體LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染入常規(guī)培養(yǎng)的BGC823(轉(zhuǎn)染18 h后，換液培養(yǎng))，分別標(biāo)記為pcDNA組、pcDNA-CircSHKBP1組、miR-NC組、miR-1294組、pcDNA-CircSHKBP1+miR-NC組、pcDNA-CircSHKBP1 +miR-1294組。用qRT-PCR法檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(>70%)。

1.2.3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn):使用RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA，在19℃將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-40℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肦T-qPCR試劑盒檢測CircSHKBP1、miR-1294的mRNA表達(dá)水平。以GAPDH、U6為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算CircSHKBP1 mRNA、miR-1294 mRNA的表達(dá)。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物信息：CircSHKBP1：上游引物，5’-AGGTCAGGCAGAGGAAGTCA-3’，下游引物,5’-CGCGTCATAACTGGTGATGG-3’；miR-1294：上游引物，5’-TATGATCTCACCGAGTCCT-3’，下游引物，5’-CACCTTCCTAATCCTCAGTT-3’；GAPDH，上游引物，5’-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3’；下游引物，5’-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3’；內(nèi)參U6用通用引物。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn):將待檢測的細(xì)胞密度調(diào)至約2×105個(gè)/ml，使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞在490 nm波長下檢測細(xì)胞OD值。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率(%)=(OD490處理組/OD490 對照組-1)×100%。

1.2.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn):先將待檢測的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h，再將細(xì)胞消化，離心棄上清，用1%血清的培養(yǎng)液調(diào)整至105個(gè)/ml，待用。取100 μl 置于上室，取600 μl含10%血清的培養(yǎng)液置于下室，常規(guī)培養(yǎng)12 h。用甲醇固定結(jié)晶紫染色染色后，對細(xì)胞拍照計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞遷移率(%)=穿膜細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%；細(xì)胞侵襲率(%)=侵襲細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6 Annexin V-/FITC實(shí)驗(yàn):Annexin V-/FITC測定法用于評估細(xì)胞的凋亡。按照Annexin V-/FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的制造商說明要求操作，用冷PBS洗滌細(xì)胞，并用500 μl的結(jié)合緩沖液懸浮。接著將5 μl的 Annexin V-FITC和5 μl的碘化丙啶加入到結(jié)合緩沖液中，最后在室溫下在黑暗環(huán)境中孵育5min，上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的染色情況。細(xì)胞凋亡率為細(xì)胞的早期凋亡率與晚期凋亡率之和。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn):通過預(yù)測網(wǎng)站https://circinteractome.nia.nih.gov/預(yù)測到CircSHKBP1與miR-1294存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)。將CircSHKBP1-WT(含CircSHKBP1結(jié)合位點(diǎn))和CircSHKBP1-MUT(不含CircSHKBP1結(jié)合位點(diǎn))的克隆到pGL3熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒載體。將BGC823細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h，用熒光素酶報(bào)告基因試劑盒測定熒光活性。

2 結(jié)果

2.1 CircSHKBP1在胃癌組織、胃癌細(xì)胞中的表達(dá) CircSHKBP1高表達(dá)患者的生存期顯著低于低表達(dá)的患者(P<0.05)。CircSHKBP1mRNA在胃癌組織中的表達(dá)較正常胃組織明顯上調(diào)(P<0.05)。CircSHKBP1mRNA在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于GES1細(xì)胞(P<0.05)。見圖1，表1、2。

圖1 不同CircSHKBP1表達(dá)水平的胃癌患者的生存率

表1 CircSHKBP1 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)

表2 CircSHKBP1 mRNA在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 過表達(dá)CircSHKBP1的BGC823細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡 與pcDNA組比較，pcDNA-CircSHKBP1組細(xì)胞中CircSHKBP1 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞增殖率、遷移率和侵襲率均明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 過表達(dá) CircSHKBP1的胃癌細(xì)胞遷移侵襲圖和凋亡圖;A 過表達(dá)CircSHKBP1的胃癌細(xì)胞遷移侵襲圖(HE×200)；B 過表達(dá)CircSHKBP1的胃癌細(xì)胞凋亡圖

表3 過表達(dá)CircSHKBP1的BGC823細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡情況

2.3 CircSHKBP1靶向miR-1294 通過Circinteractome網(wǎng)站預(yù)測到CircSHKBP1與miR-1294存在連續(xù)的7個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶檢測顯示，miR-1294組細(xì)胞的熒光活性顯著低于miR-NC組(P<0.05)，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-1294組熒光活性變化不明顯(P>0.05)。胃癌組織中miR-1294與CircSHKBP1的mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見圖3、4，表4。

表4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試驗(yàn)結(jié)果

圖3 CircSHKBP1與miR-1294的結(jié)合位點(diǎn)

圖4 胃癌組織中CircSHKBP1和miR-1294的mRNA表達(dá)

2.4 miR-1294在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá) 與正常胃組織組比較，T1-T2組、T3-T4組胃癌組織中的miR-1294 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。與GES1組比較，MGC803、HGC27、BGC823細(xì)胞中的miR-1294 mRNA的表達(dá)水平也均顯著降低(P<0.05)。見表5、6。

表5 miR-1294在胃癌組織中的表達(dá)

表6 miR-1294 mRNA在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.5 過表達(dá)miR-1294的BGC823細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡 與miR-NC組比較，miR-1294組細(xì)胞中miR-1294表達(dá)顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞增殖率、遷移率和侵襲率均顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖5，表7。

表7 過表達(dá)miR-1294對BGC823細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡的調(diào)控

圖5 過表達(dá)miR-1294的BGC823細(xì)胞遷移侵襲圖和凋亡圖;A 過表達(dá)miR-1294的BGC823細(xì)胞遷移侵襲圖(HE×200)；B 過表達(dá)miR-1294的BGC823細(xì)胞凋亡圖

2.6 過表達(dá)miR-1294逆轉(zhuǎn)CircSHKBP1對BGC823細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡的調(diào)控 與pcDNA-SHKBP1+miR-NC組比較，pcDNA-SHKBP1+ miR-1294組細(xì)胞的增殖率、遷移率和侵襲率均顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖6，表8。

圖6 過表達(dá)miR-1294和CircSHKBP1的BGC823細(xì)胞遷移侵襲圖和凋亡圖;A BGC823細(xì)胞遷移侵襲圖(HE×200)；B BGC823細(xì)胞凋亡圖

表8 過表達(dá)miR-1294逆轉(zhuǎn)CircSHKBP1對BGC823細(xì)胞的調(diào)控作用

3 討論

環(huán)狀RNA(circRNAs)是一類通過反向剪接產(chǎn)生的ncRNAs，具有穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。CircRNA在組織中富集豐富，有數(shù)千種circRNAs在腫瘤組織和正常組織中存在差異表達(dá)[7]。據(jù)報(bào)道，CircRNA hsa_circ_0004872、CircRNA-hsa-circ_ 0000670、CircRNA-circ_0026359均在胃癌的發(fā)展進(jìn)程中具有重要的調(diào)控作用，并且其作用機(jī)制均與靶向吸附miRNA有關(guān)[8-10]。最近，Xie等[3]在胃癌的研究中報(bào)道，外泌體circSHKBP1表達(dá)異常升高，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲和血管形成，其作用機(jī)制與CircSHKBP1吸附miR-582-3p，結(jié)合HSP90，進(jìn)而阻礙STUB1與HSP90的相互作用，抑制HSP90的泛素化有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，CircSHKBP1在胃癌組織中的表達(dá)異常升高，過表達(dá)CircSHKBP1具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲和抑制凋亡的作用，這與Xie等[3]的研究結(jié)果相吻合。此結(jié)果再次證實(shí)了CircSHKBP1在胃癌中的促進(jìn)癌癥惡化的功能，為CircSHKBP1用于胃癌的診斷治療提供支持。通過熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CircSHKBP1可靶向miR-1294，猜測miR-1294可能參與CircSHKBP1在胃癌中的促癌作用。

隨著高通量RNA測序技術(shù)和新型生物信息學(xué)工具的發(fā)展，已經(jīng)在各種生物體中鑒定出了數(shù)千種circRNAs。circRNAs可以通過影響轉(zhuǎn)錄、mRNA轉(zhuǎn)換以及通過吸附RNA結(jié)合蛋白和miRNA來調(diào)控基因表達(dá)[11,12]。Wu等[13]報(bào)道，miR-1294在胃癌組織和細(xì)胞中異常下調(diào)，作為豐富核轉(zhuǎn)錄本1 的靶基因調(diào)控miR-1294/AKT1-PI3K/AKT/mTOR信號通路發(fā)揮促癌作用。Wang等[14]報(bào)道，miR-1294在胃癌患者組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并且miR-1294高表達(dá)組的總生存期明顯長于miR-1294低表達(dá)組，其還可直接靶向FOXK1調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Shi等[15]報(bào)道，miR-1294在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于相鄰正常組織，這與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)相關(guān)，此外，miR-1294表達(dá)較低的胃癌患者與miR-1294表達(dá)較高的患者相比，無病生存(DFS)和總生存(OS)時(shí)間更短。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-1294在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平也是異常降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-1294能夠抑制CircSHKBP1對胃癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲促進(jìn)和凋亡抑制作用。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示了CircSHKBP1與miR-1294在胃癌中的相互作用關(guān)系，為研究CircSHKBP1在胃癌中的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

綜上所述，CircSHKBP1在胃癌中表達(dá)異常上調(diào)，并且可促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移侵襲，抑制凋亡的進(jìn)行，不利于患者生存，產(chǎn)生這種作用的機(jī)制與靶向miR-1294相關(guān)，為胃癌的臨床治療提供潛在靶點(diǎn)。