賈敏 賈凌梅 李汭儐 馬澤軍 馬進(jìn)

伴隨著冠狀動脈(冠脈)介入治療、冠脈搭橋和冠脈溶栓等治療手段的廣泛應(yīng)用，繼之出現(xiàn)的心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)造成的二次損傷為臨床冠脈介入治療、冠脈搭橋和冠脈溶栓等治療手段的有效運用帶來極大障礙[1,2]。因此圍繞前處理預(yù)防降低MI/R造成的二次損傷是目前臨床研究的熱點。線粒體是細(xì)胞的能量供應(yīng)器，心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷直接影響心肌細(xì)胞線粒體功能。MI/R引起線粒體功能障礙可以引起線粒體代謝抑制，線粒體活性氧的大量生成，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。HKⅡ是機體糖酵解關(guān)鍵限速酶，心肌線粒體保護(hù)起重要調(diào)節(jié)作用[3,4]。HKⅡ與線粒體相互作用可以穩(wěn)定細(xì)胞線粒體功能，促進(jìn)糖酵解發(fā)生，糖酵解在缺血再灌注早期可以有效補充細(xì)胞ATP能量生成，改善細(xì)胞線粒體功能及能量平衡[5]。西紅花苷(crocin)為西紅花的提取物，又稱為西紅花素，研究表明西紅花苷在心臟疾病中具有一定的保護(hù)作用，西紅花苷可以改善二嗪農(nóng)(DZN)所致的大鼠心臟損傷對大鼠心臟組織的丙二醛(MDA)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)的含量顯著降低，而谷胱甘肽(GSH)的含量有所升高，西紅花苷具有抗氧化應(yīng)激的作用[6-8]，但西紅花苷在心臟缺血再灌注中的作用及機制有待研究。本研究將采用H9c2大鼠心肌細(xì)胞建立體外缺血再灌注損傷細(xì)胞模型[9]，通過考察細(xì)胞糖酵解水平及己糖激酶評價西紅花苷對缺血再灌注損傷細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 西紅花苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號:160122)購自阿拉丁公司。H9c2大鼠心肌細(xì)胞株,購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自GIBCO公司，乳酸檢測試劑盒，NAD+/NADH 檢測試劑盒(BioVision公司)、己糖激酶抑制劑(3-BrPA)，葡萄糖檢測試劑盒(Sigma 公司)，己糖激酶試劑盒，丙酮酸激酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)，HKⅡ抗體(abcam公司)。

1.2 H9c2大鼠心肌細(xì)胞株培養(yǎng) H9c2大鼠心肌細(xì)胞株培養(yǎng)在含10%的新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。取對數(shù)生長期細(xì)胞，D-hanks液漂洗后加入含1%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.3 H9c2缺氧/復(fù)氧模型建立 將H9c2心肌細(xì)胞于37℃，95%N2，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后,10%FBS的DMEM培養(yǎng)液更換為PBS緩沖液，在缺氧復(fù)氧培養(yǎng)箱充入95%N210 min后，把缺氧復(fù)氧培養(yǎng)箱放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行缺氧4 h，然后去掉PBS緩沖液，重新加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，放置于37℃，20% O2，5%CO2中培養(yǎng)12 h后進(jìn)行檢測各項指標(biāo)。

1.4 MTT法檢測H9c2細(xì)胞存活率 將H9c2心肌細(xì)胞以1×104個/孔接種于96 孔板中，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度(20、40、80 μmol/L)的西紅花苷，己糖激酶抑制劑組及抑制劑與西紅花苷聯(lián)合組(15 μmol/L 3-BrPA +40 μmol/L西紅花苷)每孔200 μl，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，與缺氧細(xì)胞4 h后加入，培養(yǎng)12 h 后，向每孔中加入5 g/L的MTT 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，向每孔中加入二甲基亞砜100 μl溶解結(jié)晶體，置于搖床振蕩10 min，至藍(lán)紫色顆粒完全溶解后，于酶標(biāo)儀570 nm波長處測定每孔吸光度值(A)，重復(fù)3次。

1.5 檢測心肌細(xì)胞葡萄糖消耗及乳酸水平 將處于對數(shù)生長期的H9c2心肌細(xì)胞接種于12孔板中，每孔4×105個細(xì)胞，1 ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞覆蓋板底70%后建模加藥處理。設(shè)置藥物濃度為20、40、80 μmol/L，己糖激酶抑制劑組及抑制劑與西紅花苷聯(lián)合組(15 μmol/L 3-BrPA+40 μmol/L西紅花苷)，另設(shè)對照組。采用Lactate Colorimetric Assay Kit Ⅱ檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中的乳酸含量，操作按照實際盒提供的操作說明進(jìn)行;葡萄糖檢測采用Glucose(GO)Assay Kit 提供的操作說明進(jìn)行分析。

1.6 檢測心肌細(xì)胞ATP含量 將處于對數(shù)生長期的H9c2心肌細(xì)胞接種于12孔板中，每孔4×105個細(xì)胞，1 ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞覆蓋板底70%后建模加藥處理。設(shè)置藥物濃度為20、40、80 μmol/L，己糖激酶抑制劑組及抑制劑與西紅花苷聯(lián)合組(15 μmol/L 3-BrPA +40 μmol/L西紅花苷)，另設(shè)對照組。收集細(xì)胞于離心管中，10 000 r/min離心5 min，棄上清，每管加入100 μl裂解液。待細(xì)胞充分裂解后，4℃，12 000 r/min，離心10 min，取上清用于后續(xù)測定。取新96孔板，每孔加入100 μl ATP工作液(1∶100)，在室溫下放置5 min。待本底性ATP消耗完畢，避光條件下每孔加入30 μl BCA法蛋白定量后的樣品，2 s后立即檢測。以上實驗重復(fù)3次。

1.7 檢測心肌細(xì)胞NAD+/NADH變化 將處于對數(shù)生長期的H9c2心肌細(xì)胞接種于12孔板中，每孔4×105個細(xì)胞，1 ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞覆蓋板底70%后建模加藥處理。設(shè)置藥物濃度為20、40、80 μmol/L，己糖激酶抑制劑組及抑制劑與西紅花苷聯(lián)合組(15 μmol/L 3-BrPA +40 μmol/L西紅花苷)，另設(shè)對照組。采用NAD+/NADH Kit檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中的NAD+及NADH含量(BioVision,Inc,USA)，操作按照實際盒提供的操作說明進(jìn)行。

1.8 Western blot檢測HKⅡ蛋白水平的影響 收集細(xì)胞，用冰預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液洗2次，用RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白質(zhì)。提取液蛋白質(zhì)濃度用BCA 試劑盒定量。將蛋白提取液用12.5% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，將電泳分離膠通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，用HKⅡ或β-actin 單克隆抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL 試劑盒顯色發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 MTT實驗評價西紅花苷對H9c2模型細(xì)胞增殖作用的影響 隨著西紅花苷濃度的增加促進(jìn)心肌細(xì)胞細(xì)胞增殖，并具有明顯的濃度依賴性。但當(dāng)將西紅花苷與己糖激酶抑制劑聯(lián)合使用后，西紅花苷對細(xì)胞的增殖作用明顯降低。見圖1，表1。

圖1 西紅花苷對H9c2細(xì)胞增殖率細(xì)胞的影響

表1 西紅花苷對西紅花苷對H9c2細(xì)胞增殖率細(xì)胞的影響

2.2 西紅花苷可以提高H9c2模型細(xì)胞糖酵解水平 隨著西紅花苷濃度(20、40、80 μmol/L)的增加，與模型細(xì)胞比較，西紅花苷可以明顯升高H9c2模型細(xì)胞對葡萄糖的消耗，中高劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同時西紅花苷可以明顯促進(jìn)細(xì)胞乳酸生成，并均呈現(xiàn)濃度依賴性，中高劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但當(dāng)給于己糖激酶抑制劑后，西紅花苷對細(xì)胞糖酵解的影響作用顯著降低，但與抑制劑組仍差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 西紅花苷對H9c2缺氧/復(fù)氧細(xì)胞葡萄糖消耗及乳酸水平的影響

2.3 西紅花苷可以升高H9c2模型細(xì)胞線粒體能量生成 隨著西紅花苷濃度(20、40、80 μmol/L)的增加，與模型細(xì)胞組比較，西紅花苷可以明顯升高模型細(xì)胞中ATP的含量，同時降低模型細(xì)胞中NAD+/NADH的比例，提高糖酵解能量供應(yīng)水平，促進(jìn)ATP產(chǎn)生。西紅花苷對ATP含量及NAD+/NADH的影響與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明西紅花苷可以明顯升高模型細(xì)胞能力供應(yīng)水平。而給于己糖激酶抑制劑后，西紅花苷對細(xì)胞能量供應(yīng)的影響作用顯著降低，但與抑制劑組仍有差異(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 西紅花苷對H9c2細(xì)胞ATP含量及NAD+/NADH的影響

圖2 西紅花苷對H9c2缺氧/復(fù)氧細(xì)胞HKⅡ的蛋白表達(dá)的影響

2.4 西紅花苷可升高H9c2細(xì)胞中己糖激酶活性 在H9c2細(xì)胞中，不同劑量的西紅花苷均可以明顯升高己糖激酶的活性，但當(dāng)給予己糖激酶抑制劑后對己糖激酶活性明顯降低。見表4。

表4 6組己糖激酶相對活性檢測結(jié)果

2.5 西紅花苷促進(jìn)H9c2模型細(xì)胞HKⅡ表達(dá) 通過Western blot檢測川楝素對H9c2細(xì)胞HKⅡ的蛋白表達(dá)影響，結(jié)果表明在H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型中HKⅡ表達(dá)降低，當(dāng)給于西紅花苷后可明顯促進(jìn)HKⅡ表達(dá)升高，但是當(dāng)給于己糖激酶抑制劑后，該作用明顯降低，但與抑制劑組仍具有顯著差異。見圖2，表5。

表5 西紅花苷對H9c2缺氧/復(fù)氧細(xì)胞HKⅡ的蛋白表達(dá)的影響

3 討論

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的發(fā)生率逐年增高。MIRI是指心肌在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆損傷的現(xiàn)象，常發(fā)生于心肌梗死血管再通、冠脈痙攣解除、心臟移植、心肺手術(shù)體外循環(huán)及心肺復(fù)蘇后。導(dǎo)致MIRI發(fā)生的機制復(fù)雜，多種生物活性分子及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均參與該類疾病的發(fā)生發(fā)展[1,2]。

急性心肌缺血時，無氧糖酵解代謝承擔(dān)能源生產(chǎn)的核心作用，由于缺乏氧氣氧化磷酸化不能出現(xiàn)。從而轉(zhuǎn)向無氧代謝，無氧代謝需要葡萄糖的吸收，迅速增加糖原分解和糖酵解。但在嚴(yán)重缺血后，由于氫離子和糖酵解中間產(chǎn)物的積累，最終抑制糖酵解，導(dǎo)致細(xì)胞能量供應(yīng)水平下降進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生。研究表明葡萄糖和胰島素促進(jìn)的葡萄糖代謝可以有效的用于保護(hù)心臟在MI/R損傷[10,11]。本研究通過采用H9c2細(xì)胞建立缺氧/復(fù)氧模型，發(fā)現(xiàn)模型建立后細(xì)胞糖酵解水平明顯低于正常組，葡萄糖消耗、乳酸水平明顯降低，當(dāng)給于西紅花苷后可以明顯提高細(xì)胞葡萄糖消耗、乳酸水平，促進(jìn)糖酵解，同時可以有效促進(jìn)細(xì)胞ATP含量升高，促進(jìn)細(xì)胞能量供應(yīng)。在成人心臟，MI/R發(fā)生時，HKⅡ亞細(xì)胞定位發(fā)生改變，由于G6P的積累導(dǎo)致由線粒體向胞漿轉(zhuǎn)移，促進(jìn)糖酵解的發(fā)生，為細(xì)胞提供能量補充。己糖激酶Ⅱ(HexokinaseⅡ，HKⅡ)作為機體糖酵解關(guān)鍵調(diào)控蛋白，是糖酵解的第一步限速酶[12]。同時在實驗中我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)給于己糖激酶抑制劑后，模型細(xì)胞糖酵解水平明顯降低，當(dāng)給于抑制劑組聯(lián)合使用西紅花苷后，可以有效提高抑制劑組模型細(xì)胞糖酵解水平。此外己糖激酶不僅參與細(xì)胞糖酵解的過程，還參與調(diào)節(jié)線粒體功能和細(xì)胞凋亡；包括結(jié)合并調(diào)節(jié)線粒體電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel，VDAC)和mPTP的形成及調(diào)控。VDAC能夠與已糖激酶(hexokinase，HK)結(jié)合，HK能夠促進(jìn)通道關(guān)閉，抑制ATP通過VDAC進(jìn)出線粒體。同時HK與VDAC結(jié)合會使Bax與線粒體結(jié)合會降低，從而表現(xiàn)出抑制凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)HK與VDAC連接愈密切，可以明顯促進(jìn)線粒體穩(wěn)定性，減少凋亡發(fā)生，從而保護(hù)細(xì)胞功能[13-15]。

本實驗結(jié)果表明，西紅花苷可以有效促進(jìn)己糖激酶活性并升高己糖激酶蛋白表達(dá)。本研究初步表明西紅花苷在缺血再灌注損傷中可以有效提高心肌糖酵解水平，改善缺血再灌注導(dǎo)致是細(xì)胞損傷并對細(xì)胞己糖激酶具有顯著調(diào)節(jié)作用，而西紅花苷在己糖激酶中的調(diào)節(jié)機制還有待進(jìn)一步探究。