穆元忠 郭虎林 楊世榮 趙 剛

(青海省第五人民醫(yī)院泌尿外科，西寧市 810007，電子郵箱：554727303@qq.com)

前列腺癌屬于泌尿系統(tǒng)惡性疾病，多見于老年男性，其發(fā)病率受地區(qū)和人種的影響。在歐美地區(qū)，每年前列腺癌的發(fā)病率和致死率都位居所有腫瘤的前列，而我國前列腺癌的發(fā)病率也呈逐年上升的嚴(yán)峻態(tài)勢(shì)[1]。前列腺癌早期癥狀不明顯，且癌細(xì)胞易轉(zhuǎn)移、耐藥性強(qiáng)、預(yù)后效果差，術(shù)后生存率在30%以下[2]。癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及惡化的病理基礎(chǔ)，共同調(diào)控腫瘤疾病的進(jìn)程[3-5]。因此，深入研究前列腺癌的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展規(guī)律，以及相關(guān)促癌基因、抑癌基因?qū)Π┌Y發(fā)生和發(fā)展的作用，對(duì)降低前列腺癌患者的死亡率和術(shù)后復(fù)發(fā)率具有重要意義。最近研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程可能與有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2(organic cation transporter 2，OCT2)存在一定的相關(guān)性[6]，然而目前國內(nèi)有關(guān)前列腺癌和OCT2之間的關(guān)系的研究仍較少。目前已有較多研究報(bào)告腫瘤的發(fā)生與微小RNA相關(guān)，其中微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)的表達(dá)水平與前列腺癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。本研究通過檢測(cè)OCT2與miR-21在前列腺癌和良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)組織中的表達(dá)情況，探討OCT2與miR-21表達(dá)水平與前列腺癌臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年4月至2016年6月于我院確診為前列腺癌并進(jìn)行腫瘤切除手術(shù)的105例患者作為觀察組。年齡40～75(58.8±11.2)歲；有吸煙史50例；臨床分期T1～T2期 56例，T3～T4期49例；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例；癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移33例；血清前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)水平在5～15 ng/mL之間86例，15 ng/mL以上19例；Gleason評(píng)分<7分77例，≥7分28例；低中危患者48例，高?；颊?7例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理活檢及術(shù)后病理檢查確診為前列腺癌；(2)無術(shù)前化療、放療史；(3)臨床病理資料完整；(4)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有其他惡性腫瘤者；(2)伴有前列腺增生者；(3)伴有嚴(yán)重出血傾向者；(4)不能積極配合治療者；(5)有精神疾病者。選取同期在我院進(jìn)行前列腺電切術(shù)治療的89例BPH患者作為對(duì)照組。年齡41～76(58.8±11.1)歲；有吸煙史42例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)BPH的診斷符合《泌尿外科學(xué)》[9]《中國泌尿外科疾病診斷治療指南(2014版)》[10]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)前列腺體積超過80 mL；(3)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他泌尿系統(tǒng)疾病者；(2)呼吸、循環(huán)、消化等其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者；(4)有精神疾病者；(5)不能配合治療者。兩組患者的年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具有可比性。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器 Anti-OCT2抗體(批號(hào)：bs-1066R)購自德國ChromoTek公司，miR-21兔單克隆抗體(批號(hào)：20180402)購自恒瑞醫(yī)藥有限公司，山羊抗兔二抗(批號(hào)：ab150077)購自嘉和生物有限公司，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色盒(批號(hào)：20130526)購自信達(dá)生物有限公司，蘇木精染色液購自百濟(jì)神州生物有限公司(批號(hào)：C8470)。普通光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：CX21)購自上海豐實(shí)試驗(yàn)儀器有限公司，石蠟切片機(jī)(型號(hào)：RM2245)購自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 免疫組化染色 將前列腺癌組織和前列腺增生組織制成標(biāo)準(zhǔn)的石蠟切片，脫蠟后，依次在二甲苯Ⅰ中浸泡5 min、二甲苯Ⅱ中浸泡5 min、無水乙醇Ⅰ中浸泡3 min、無水乙醇Ⅱ中浸泡3 min、95%乙醇中浸泡3 min、85%乙醇中浸泡3 min、75%乙醇中浸泡3 min。用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3次，每次5 min。切片煮沸15 min，蒸餾水沖洗2次，每次3 min。雙氧水中孵育10 min，PBS 沖洗3次，每次3 min。滴加3 mL 1∶800稀釋的anti-OCT2一抗、2 mL 1∶800稀釋的miR-21兔單克隆一抗，5℃孵育過夜。次日用PBS沖洗3次，每次5 min。滴加2 mL二抗，40℃孵育2 h，PBS 沖洗5 min。DAB顯色2～8 min，蒸餾水充分沖洗，然后采用蘇木精復(fù)染色2～3 min，記錄顯色情況，樹膠封片，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.4 結(jié)果判定 在高倍鏡(200倍和400倍)下隨機(jī)選擇每個(gè)切片的5個(gè)視野進(jìn)行觀察，參考400倍鏡下細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率進(jìn)行評(píng)分。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分方法：棕黃色為2分，淺黃色為1分，無陽性著色為0分。陽性細(xì)胞率計(jì)分方法：≥75%為5分，50%～<75%為4分，25%～<50%為3分，10%～<25%為2分，5%～<10%為1分，<5%為0分。將兩項(xiàng)結(jié)果相乘計(jì)算總分，6分為強(qiáng)陽性、3～4分為中度陽性、1～2分為弱陽性、0分為陰性，陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)/(陽性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))×100%。染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞率評(píng)分相乘的總分≤6分為低表達(dá)組，≥7分為高表達(dá)組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用GraphPad Prism軟件繪制 Kaplan-Meier生存曲線，生存率差異比較采用log-rank檢驗(yàn)；采用Cox回歸模型分析影響前列腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者病灶組織中OCT2和miR-21的表達(dá)情況的比較 免疫組化染色結(jié)果顯示，OCT2主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，miR-21主要分布于細(xì)胞膜中，陽性細(xì)胞呈棕黃色，見圖1。觀察組患者OCT2的高表達(dá)率低于對(duì)照組，而miR-21的高表達(dá)率高于對(duì)照組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者OCT2和miR-21表達(dá)情況的比較[n(%)]

圖1 OCT2和miR-21的免疫組化圖像

2.2 OCT2、miR-21表達(dá)情況與前列腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 不同臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、PSA水平、Gleason評(píng)分及危險(xiǎn)程度的前列腺癌患者病灶組織中的OCT2及miR-21高表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，臨床分期為T1～T2期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、PSA水平在5～15 ng/mL、Gleason評(píng)分<7分、低中危前列腺癌患者的OCT2高表達(dá)率更高，miR-21高表達(dá)率更低(均P<0.05)；而不同年齡、吸煙情況的前列腺癌患者病灶組織中的OCT2及miR-21高表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 OCT2、miR-21表達(dá)情況與前列腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 OCT2、miR-21表達(dá)情況與前列腺癌患者術(shù)后生存率的關(guān)系 截止至2020年6月，105例前列腺癌患者術(shù)后隨訪2～80個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為40個(gè)月，其中術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)35例、死亡25例，總生存率為 76.2%。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，OCT2高表達(dá)患者的總生存率(93.3%)明顯高于低表達(dá)率患者(75.4%)(χ2=8.965，P<0.001)，而miR-21高表達(dá)患者的總生存率(73.2%)低于低表達(dá)患者(95.0%)(χ2=9.564，P=0.001)。見圖2。

圖2 前列腺癌患者術(shù)后Kaplan-Meier生存曲線

2.4 前列腺癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析 將前列腺癌患者的年齡、吸煙情況、前列腺癌組織中OCT2和miR-21的表達(dá)情況、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、PSA水平、Gleason評(píng)分、危險(xiǎn)分級(jí)等因素作為自變量納入Cox回歸模型進(jìn)行分析，賦值情況見表3。單因素分析結(jié)果顯示，前列腺癌患者前列腺癌組織中OCT2和miR-21的表達(dá)情況、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、PSA水平、Gleason評(píng)分、危險(xiǎn)分級(jí)是影響前列腺癌患者預(yù)后的因素(均P<0.05)；多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，前列腺癌患者前列腺癌組織中OCT2和miR-21的表達(dá)情況、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、PSA水平、Gleason評(píng)分、危險(xiǎn)分級(jí)是前列腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(均P<0.05)。見表4。

表3 變量賦值情況

表4 前列腺癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

3 討 論

因存在個(gè)體差異，不同個(gè)體前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程不同，部分前列腺癌患者癥狀不明顯，且發(fā)展較慢，而部分患者的病情則會(huì)迅速發(fā)展，出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移及其他器官轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致死亡[11]。因此，明確前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，尋找有效預(yù)測(cè)病情進(jìn)展的分子生物標(biāo)志物，能夠?yàn)榍傲邢侔┗颊邘砀Ｒ鬧12]。OTC2由SLC22A2基因編碼，位于6q26上，其二級(jí)結(jié)構(gòu)具有12個(gè)跨膜區(qū)域，OCT2多表達(dá)于腎臟中，能夠影響腎小管對(duì)尿液的重吸收，其主要分布在腎近曲小管基底側(cè)、前列腺、小腸和肺部[13]。OCT2在前列腺中主要分布于前列腺細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)特定的有機(jī)陽離子，包括組胺和膽堿類產(chǎn)物等內(nèi)源性物質(zhì)，以及二甲雙胍、奧沙利鉑等外源性代謝產(chǎn)物，涉及臨床上很多內(nèi)源性物質(zhì)和相關(guān)藥物的代謝過程，推測(cè)其能夠成為治療前列腺癌的新型靶點(diǎn)[14]。血清PSA水平的檢測(cè)為目前臨床上早期篩查前列腺癌的手段之一，但存在假陰性和假陽性的可能，因此，急需尋找更準(zhǔn)確的前列腺癌篩查指標(biāo)[15]。核糖核酸型生物標(biāo)志物有檢測(cè)方便、準(zhǔn)確性高、在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在等優(yōu)勢(shì)，是非常有潛力的腫瘤標(biāo)志物[16]。研究表明，miR-21可通過對(duì)下游基因的調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，從而影響包括前列腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[17]。目前已有不少學(xué)者研究前列腺癌組織中miR-21的表達(dá)情況[18]。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)前列腺癌及BPH組織標(biāo)本中OCT2及miR-21的表達(dá)情況，并分析其與前列腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。免疫組化分析結(jié)果顯示，OCT2主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，miR-21主要分布于細(xì)胞膜中，陽性細(xì)胞呈棕黃色；觀察組患者的OCT2高表達(dá)率低于對(duì)照組，而miR-21高表達(dá)率高于對(duì)照組(均P<0.05)，這說明前列腺癌組織中的OCT2表達(dá)被抑制，而miR-21在前列腺癌組織中的表達(dá)增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，臨床分期為T1～T2期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、PSA水平在5～15 ng/mL、Gleason評(píng)分<7分、低中危前列腺癌患者的OCT2高表達(dá)率更高，miR-21高表達(dá)率更低(均P<0.05)，這說明前列腺癌組織中OCT2和miR-21的表達(dá)情況與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、疾病危險(xiǎn)程度有關(guān)；而不同年齡、吸煙情況的前列腺癌患者病灶組織中的OCT2及miR-21高表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，這提示：前列腺癌患者病灶組織中的OCT2及miR-21的表達(dá)水平與患者年齡和吸煙情況可能沒有關(guān)系。本研究還對(duì)前列腺癌患者術(shù)后進(jìn)行隨訪，生存分析結(jié)果顯示，OCT2高表達(dá)的前列腺癌患者的總生存率明顯高于OCT2低表達(dá)的患者，而miR-21高表達(dá)的前列腺癌患者的總生存率則明顯低于miR-21低表達(dá)的患者(均P<0.05)，這提示促進(jìn)前列腺癌組織中OCT2表達(dá)和抑制前列腺癌組織中miR-21表達(dá)能夠顯著抑制前列腺癌的復(fù)發(fā)或發(fā)展，從而提高患者的術(shù)后生存率。本研究Cox回歸分析結(jié)果顯示，患者前列腺癌組織中OCT2和miR-21的表達(dá)情況、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、PSA水平、Gleason評(píng)分、危險(xiǎn)分級(jí)均是前列腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(均P<0.05)，這說明上述因素或可作為評(píng)估前列腺癌患者預(yù)后情況的指標(biāo)。

根據(jù)本研究的免疫組化分析結(jié)果，推測(cè)前列腺癌的惡性程度和侵襲性可能與前列腺組織中OCT2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與miR-21的表達(dá)水平呈正相關(guān)，但是本研究未比較OCT2、miR-21的表達(dá)情況與血清PSA水平診斷前列腺癌的效能，也未對(duì)術(shù)后患者疾病復(fù)發(fā)時(shí)前列腺組織中的OCT2、miR-21水平進(jìn)行檢測(cè)，因此，今后有待于進(jìn)一步研究。此外，有學(xué)者認(rèn)為遺傳、尿路感染史、吸煙和肥胖也與前列腺癌的發(fā)生相關(guān)[19-20]，OCT2、miR-21的表達(dá)是否會(huì)受這些因素的影響，今后還需要進(jìn)一步完善研究，探討OCT2、miR-21在前列腺癌中的具體調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，在前列腺癌組織中OCT2呈低表達(dá)，而miR-21呈高表達(dá)，其與前列腺癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、PSA水平、Gleason評(píng)分和危險(xiǎn)分級(jí)相關(guān)，且均為前列腺患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子。OCT2、miR-21或可作為前列腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在標(biāo)志物。