鄭冰靜 許世初 屠鈺歡 鄒 帆 梁丹丹 王 海 莫億偉

(紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 紹興 312000)

1 銅脅迫對植物生長和生理代謝的影響

銅是植物體正常生命活動所需的營養(yǎng)元素,廣泛參與多種新陳代謝途徑,在促進植物體優(yōu)質(zhì)增產(chǎn)和提高植物抗逆性方面均有重要作用[1].有研究表明,在正常植物體內(nèi),Cu2+含量約為5～30 mg/kg[2],低濃度Cu2+既是多種酶如硝酸還原酶的組成成分,又可為蛋白質(zhì)的合成提供相應(yīng)的輔酶和輔基[3],同時還是葉綠體上光合電子傳遞鏈的重要組分,適量Cu2+能促進蔗糖等碳水化合物向莖稈流動,促進花粉管的伸長等[4].近年來,由于冶煉、五金、采礦和電子產(chǎn)品等產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展,重金屬污染也日益加劇,每年土壤中的Cu2+增幅約為2.5～9.0 mg/kg,遠遠超過植物所需[2,5].Cu2+可隨著大氣循環(huán)、水循環(huán)進入農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng),直接影響多種作物的生長,如受銅脅迫后會導(dǎo)致水稻植株瘦小,葉黃,分蘗減少,抽穗期和成熟期推遲,使作物生長發(fā)育遲緩,產(chǎn)量降低.Cu2+還可以通過食物鏈進行轉(zhuǎn)移,若在人體內(nèi)發(fā)生富集將直接危害人類健康[6-7].近年來,納米材料已廣泛應(yīng)用于多種行業(yè),而這些納米顆粒(NPs)也具有植物毒性[8],如納米氧化銅(nCuO)在500 mg/L時就能顯著抑制玉米的生長,并能導(dǎo)致細胞膜透性的增加[9], 當(dāng)Cu2+的濃度超過1.0 mg/L時,細胞膜相對透性會隨著Cu2+處理濃度的上升而增大,其中Cu2+達8.0 mg/L時質(zhì)膜透性達37.71%,過量Cu2+及納米銅(nCu)對植物的生長及人類的健康均有傷害作用[10].

1.1 銅對植物種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

在植物種子萌發(fā)和幼苗生長等階段,受到溫度、光照和無機鹽等多種因素的強烈控制,如Cu2+、Fe2+、Zn2+和Mn4+等在植物體轉(zhuǎn)運吸收及保護機制中存在緊密聯(lián)系[11],其中,重金屬脅迫在植物幼苗期影響最大[12].但在低濃度的銅、鎘脅迫條件下,先農(nóng)10號、20號、40號水稻發(fā)芽勢和發(fā)芽率與對照相比無顯著的差異,這可能是由于在種子萌發(fā)階段,重金屬銅、鎘被阻隔在種表皮之外,因此沒有造成脅迫傷害,有些反而還能促進種子的萌發(fā)[12-13].而在Cu2+和Zn2+復(fù)合溶液脅迫下,840 mg/L濃度時,蓖麻種子萌發(fā)率顯著降低,僅為對照的45.07%,且隨著復(fù)合濃度增加,種子根逐漸由綠轉(zhuǎn)為黑[14].前人對重金屬銅、鎘抑制幼苗初期研究發(fā)現(xiàn),Cu2+脅迫對水稻根的生長抑制效果最為明顯,可能是水稻根直接與Cu2+的環(huán)境接觸所致；隨Cu2+濃度增加,其對根長的生長抑制作用更為強烈,而且對株高抑制作用也隨Cu2+脅迫濃度遞增而增強[15],隨著Cu2+含量的增加,水稻的產(chǎn)量也呈指數(shù)下降[16].如在水培濃度為15～25 mg/L時,小麥胚根數(shù)目減少,水培7～10 d時,由于根尖受害萎縮,胚根條數(shù)與長度皆表現(xiàn)下降趨勢[17],究其原因,銅的毒性可能直接損害了根系的生長和功能,從而抑制水分和養(yǎng)分吸收,進而影響地上部的生長發(fā)育[7].但在水稻生長的不同生命階段,nCuO對水稻產(chǎn)生的毒害也不太一樣, 如用0.5 mM、1.0 mM和1.5 mM的nCuO處理水稻種子時,會抑制種子萌發(fā)及地上部和根系的生長,并對水稻幼苗造成氧化損傷,自分蘗期開始,植株長度和生物量下降,在抽穗期,用高濃度nCuO(1 000 mg/L)處理后,則能對水稻植株引起致死效應(yīng)[9].如高濃度的CuO-NPs(>100 mg/kg Cu)可導(dǎo)致根系滲出量增加,Cu2+吸收能力增強,植物根系長度和生物量降低,破壞地上部的銅穩(wěn)態(tài)而改變了根系的形態(tài)[18].所以推測NPs毒性的機理如下：1)形成活性氧(ROS),產(chǎn)生氧化應(yīng)激；2)NPs滲透進入細胞,干擾細胞代謝；3)NPs所釋放的金屬離子會影響酶功能正常發(fā)揮；4)DNA損傷或基因突變；5)NPs在植物體表面具有吸附作用,局部富集離子.銅毒害還可通過誘導(dǎo)植物細胞活性氧的產(chǎn)生,引起質(zhì)膜透性增大,細胞中內(nèi)容物滲出,嚴重將導(dǎo)致細胞死亡[9].

1.2 銅脅迫對植物根尖細胞分裂的根系生長的影響

1.3 銅脅迫對植物幼苗葉片葉綠素含量的影響

Mg2+是葉綠素的組成成分之一,有利于維持細胞結(jié)構(gòu)完整,抵御不良環(huán)境[26],葉綠素含量的多少在一定程度上反映了植物生長狀況和光合效率強弱,當(dāng)葉綠素含量少時,勢必降低光合速率.在銅脅迫的條件下,葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞是銅脅迫毒害植物幼苗的重要表征之一[27],如受銅脅迫后作物的萌發(fā)率和生長受到顯著抑制,葉綠素含量降低,影響其光合速率,使生物量下降,并降低多種酶活性,造成不可逆的毒害作用[13].隨著銅脅迫的濃度增加,黑麥草的葉綠素含量呈明顯降低趨勢,當(dāng)CuSO4質(zhì)量濃度達320 mg/L,葉綠素a含量為對照組的33.6%,葉綠素b含量為對照組的37.5%,說明銅脅迫能顯著降低葉綠素含量[28].深入研究發(fā)現(xiàn),高濃度銅脅迫下,紫穗槐葉綠素a和葉綠素b的含量下降,重要的光合蛋白PsbD、PsbO和PsaA的表達量均下調(diào),從而抑制了光合作用[29].究其原因,可能是重金屬銅積蓄會引起細胞氧化損傷、干擾光合作用,進而影響了植物轉(zhuǎn)運及輸送營養(yǎng)能源[30].前人采用盆栽實驗研究磷、銅對小麥的互作時,發(fā)現(xiàn)小麥缺鐵是由銅毒害引起,小麥葉片黃化嚴重,葉綠素含量急劇下降[31].在小麥幼苗種植過程中添加外源鈣有助于受銅脅迫小麥的解毒,當(dāng)銅濃度為0.025 mM時,4 mM和8 mM的鈣加入有助于提高葉綠素含量,并隨濃度增加,效果更明顯[1].此外,銅脅迫降低了植株的光合勢和總?cè)~綠素含量,抑制了葉綠素?zé)晒?并降低了PSI、PSII和LHCII的活性從而影響光合作用[29,32].用不同濃度CuSO4處理1個月齡的紫菜幼苗6 d,發(fā)現(xiàn)子葉離體的真葉的光合色素含量顯著下降.而CuSO4的毒性水平對真葉和子葉的光化學(xué)沒有顯著的負面影響.結(jié)果表明,紫草子葉具有規(guī)避銅毒害的潛力,可有效地用于銅污染土地的植物修復(fù)[33].當(dāng)Cu2+為50 mg/kg時,苦草葉片葉綠素量達到最大值,而后葉綠素含量隨著Cu2+濃度的增加而減少,最終趨于穩(wěn)定[34].因此銅脅迫對葉片的傷害主要是影響葉綠素的合成,一方面可能抑制葉綠素合成酶的活性,另一方面可能直接影響葉綠體光合色素的形成或者導(dǎo)致光合電子傳遞鏈?zhǔn)軗p,從而致使光合速率降低[7].但是Cu2+對不同植物葉片具體的脅迫機制還需要深入探討.

1.4 銅對植物抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的影響

有研究表明,Cu2+作為一種氧化還原激活因子,可刺激ROS的產(chǎn)生,并引發(fā)植物的氧化應(yīng)激反應(yīng),從而破壞和干擾多種重要的細胞生理過程,如電子傳遞、酶形成、光合作用、質(zhì)膜通透性及其他代謝機制,最終表現(xiàn)出抑制植物的生長發(fā)育,而植物必須通過抗氧化酶防御系統(tǒng)來清除過多的ROS,從而免受氧化損傷[35-37].如芽孢桿菌USTB-O是一種抗銅細菌,施用芽孢桿菌USTB-O后,可提高小麥幼苗中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的活性,降低ROS和H2O2水平,降低銅對小麥幼苗的毒性[38]. 李鋒民等[39]研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)Cu2+濃度大于0.5 mM時,其根部的SOD和POD受到顯著抑制,其中最先接觸Cu2+的根部會受到氧化脅迫傷害,由于Cu2+從根部運輸?shù)竭_地上部需要一定時間,所以地上部分受到氧化傷害的時間要晚于根部.過氧化氫(H2O2)是一種相對穩(wěn)定易透過膜、可調(diào)節(jié)基因表達的輔助因子,參與各種生理過程[40],Zhang等[36]證實銅脅迫下,水稻胚根的H2O2作用于CuZn-SOD表達的上游,這些基因的過量表達會降低H2O2在水稻細胞中的積累,并通過上調(diào)抗氧化酶活性來增加水稻的耐受性.其中的抗壞血酸過氧化物酶(APX)、非特異性過氧化物酶(GPX)和SOD通常被用來評估銅對酶防御系統(tǒng)的氧化損傷作用,與對照相比,在250 μM銅脅迫下小麥幼苗APX、 GPX和SOD活性分別降低13.6%、27.3%和17.6%,在500 μM銅脅迫下小麥幼苗APX、 GPX和SOD活性分別降低了38.6%、40.9%和30.9%,而外源的吲哚-3-乙酸(IAA)或精胺(Spd)則能緩解銅毒害對小麥幼苗的APX、GPX和SOD活性的影響,提高小麥幼苗對銅脅迫的抗性[41].除了抗氧化酶參與對銅脅迫的抗性以外,抗氧化物質(zhì)如谷胱甘肽(GSH)也可清除多余的ROS,與對照組相比,在高濃度的nCu脅迫下,小麥植株中的GSH含量降低至50%,同時在高濃度的Cu2+處理下,小麥植株中的GSH含量低至37%,說明小麥遭受氧化脅迫[21],導(dǎo)致植株體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)受到傷害.

2 降低銅脅迫的相關(guān)措施

雖然大多數(shù)植物已經(jīng)進化出一套適應(yīng)性機制來部分緩解過量銅脅迫產(chǎn)生的危害,如液泡中的固存、金屬螯合物的形成和細胞壁固定[42].然而,大量的研究表明,受重金屬銅毒害的作物,其抗氧化防御系統(tǒng)(尤其是抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán))受到破壞,并抑制其根部的正常生長發(fā)育,故如何有效解除銅脅迫成為維持植物正常生長發(fā)育中亟待解決的難題之一[43].有研究表明,添加外源NO、GSH、抗壞血酸、稀土等均能改善植物體根系生長發(fā)育環(huán)境,緩解Cu2+對幼苗的毒害.如施用氮肥時,可明顯緩解水稻在低于50 mg/L Cu2+的脅迫,但當(dāng)Cu2+濃度高于50 mg/L時,氮肥的施加反而明顯抑制植物生長,對Cu2+的毒害效應(yīng)起負相關(guān)作用[5].還有研究表明,給水稻幼苗供應(yīng)NO3-有助于升高植物體內(nèi)ROS水平,對調(diào)節(jié)機體穩(wěn)態(tài)具有重要意義[22],外源GSH能顯著提高在CuCl2脅迫下的水稻種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力系數(shù),同時增加根長以及根生長的數(shù)量,其中100 mg/L的GSH對提高水稻種子萌發(fā)的效果最明顯；同時濃度為50 mg/L和100 mg/L的GSH對緩解銅對幼根的毒害效應(yīng)最顯著[44].施用外源GSH可減少水稻和棉花中過量的Cu2+積累,對維持礦質(zhì)動態(tài)平衡有積極作用,結(jié)果表明施用外源的GSH可抑制植株對Cu2+的積累,維持Ca2+、Mg2+的穩(wěn)態(tài),保護光合色素,激活抗氧化防御機制[45].

外添稀土元素鑭可提高水稻對銅脅迫的抗性,降低質(zhì)膜的透性[3].而從小麥根中分離的內(nèi)生細菌B.altitudinisWR10具有很高的抗銅性(2 mM)和生物吸附能力, 在銅脅迫下, 施用B.altitudinisWR10作菌肥的小麥比未接種WR10的小麥根長和干重分別高了1.39倍和1.56倍,同時WR10還減輕了銅引起的鋅和錳缺乏癥[38].此外,添加外源硅對受銅脅迫的小麥幼苗具有緩解作用,對根尖組織進行亞顯微結(jié)構(gòu)觀察,發(fā)現(xiàn)不加硅的小麥根尖細胞在銅逆境脅迫下出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細胞器空泡化或消失,而添加外源硅的小麥根尖細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體細胞器仍在,未見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化,說明添加外源硅后能降低銅脅迫對小麥根尖細胞器造成的損傷[46].另外,硫硅配施也可在銅污染的農(nóng)田中降低銅在水稻中的生物積累量,加快生長速度,其中0.013 g/kg的硫肥與1.0 g/kg的硅肥合理配施效果佳[47].此外,50 μM IAA和1 000 μM Spd可緩解小麥種子受銅脅迫的效應(yīng),改善幼苗生長狀況、提高相對含水量、滲透保護劑濃度、抗氧化系統(tǒng)活性并改善莖組織結(jié)構(gòu),同時減少電解質(zhì)滲漏[41].還有研究表明,除草劑(DCMU)能降低Cu2+毒害引起的氧化損傷,提高谷胱甘肽還原酶、抗壞血酸和POD的活性,從而增強細胞的抗氧化能力[24],而外源的DCMU如何提高植株對銅脅迫的抗性還需要深入研究.

在分子水平上,有研究表明,超表達水稻OsHIP24、OsHIP34和OsHIP60基因后會明顯提高水稻對銅、鋅和鎘的抗性.經(jīng)體外金屬結(jié)合試驗表明,OsHIP24蛋白質(zhì)能與銅和鎘結(jié)合,對過量的銅和鎘有緩解的作用[48].其中OsHIP24在根成熟區(qū)的根和莖維管束中表達較高,包括在葉片、節(jié)和節(jié)間等,表明了將Cu2+有輸入維管束的可能作用,OsHIP24通過維管束途徑對Cu2+從根到莖的遠距離轉(zhuǎn)運起著重要作用,還會直接影響到花藥的發(fā)育[49].同時,還有研究發(fā)現(xiàn),OsHIPP24在水稻中突變會增加根中的Cu2+濃度,但OsHIPP24強大的遠距離運輸能力引發(fā)了莖中更大的銅積累.因此,當(dāng)這些相關(guān)的基因突變后,則表現(xiàn)出植株發(fā)育遲緩[48].受銅脅迫的植物會在一定程度上形成適應(yīng)機制,如水稻中OsHMA4基因在葉片表達,可將籽粒銅阻隔在液泡外,減少銅在水稻中的富集作用,從而在一定程度上增強對銅的耐受性[50-51].因此不同植物在受到銅脅迫后會產(chǎn)生相應(yīng)的策略來降低傷害,以提高生存能力.

3 研究銅脅迫必要性和未來的研究展望

雖然前人在植物應(yīng)對銅脅迫方面已取得很多的成果,但不同植物間對銅脅迫的耐性和引起毒害的濃度也有差異,而且隨著電子產(chǎn)品廢棄物垃圾的增多,城市周邊的土壤和農(nóng)作物受Cu2+的毒害將會更加嚴重.Cu2+通過農(nóng)作物根系吸收后,積累在糧食和蔬菜等多種作物的體內(nèi),通過食物鏈直接影響到人類的健康,所以將來的研究應(yīng)該加強在生理和分子水平上Cu2+對不同作物傷害機制和可能耐銅機制的探討,并厘清Cu2+在主要農(nóng)作物吸收和代謝過程的示蹤及其在食物鏈中的傳遞方向,最終在生理、細胞和分子水平上闡明銅脅迫對主要農(nóng)作物的傷害機制,深入了解作物對銅隔離和拒銅機制,為將來在生產(chǎn)上進一步采取相應(yīng)的農(nóng)藝措施或基因工程育種手段來降低銅脅迫提供新的理論依據(jù).