邱 偉，王永兵，趙曉暉，王云峰，徐 斌，楊 娟，劉慧琴，徐白瑩

(上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院，上海 201200)

帕金森病是一種常見的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，便秘是帕金森病的一個(gè)危險(xiǎn)因素，并且貫穿整個(gè)病程[1]。α-突觸核蛋白(α-Syn)是帕金森病的病理標(biāo)志物，其經(jīng)交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)沉積，通過腦-腸-微生物軸雙向相互作用[2]，干預(yù)腸道α-Syn的傳遞有望成為帕金森病的治療新途徑。相關(guān)研究顯示，中藥可以改善帕金森病的運(yùn)動癥狀和非運(yùn)動癥狀，且不良反應(yīng)要小于常用的西藥[3]。本實(shí)驗(yàn)觀察了抗帕顆粒與酪酸梭菌活菌對帕金森病小鼠模型腸壁、迷走神經(jīng)、大腦黑質(zhì)組織中α-Syn及黑質(zhì)紋狀體中酪氨酸羥化酶(TH)表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康C57BL/6雄性6周齡小鼠50只，體重20～22 g，由上海靈暢生物科技公司供應(yīng)，動物許可證號：SCXK(滬)2018-0003。實(shí)驗(yàn)于復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院進(jìn)行；飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～24 ℃，相對濕度40%～70%，工作照度150～300 Ix，動物照度15～20 Ix，12 h晝夜節(jié)律喂養(yǎng)。小鼠自進(jìn)入動物房起，每周稱重1次，直到整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2主要試劑 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)購自美國Sigma公司，抗帕顆粒(由熟地、山萸肉、紅參、生黃芪、丹參、水蛭、全蝎、僵蠶組成)由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院提供[通制劑(2001)02-050]，酪酸梭菌活菌購自上海信誼藥廠有限公司，兔抗大鼠TH單克隆抗體、羅達(dá)明標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗、FITC 標(biāo)記羊抗小鼠Ⅱ抗購于美國CST公司，小鼠抗大鼠α-Syn 單克隆抗體購自英國abcam 公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗及HRP標(biāo)記的羊抗小鼠Ⅱ抗購自proteintech公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 在小鼠8周齡時(shí)，隨機(jī)分為空白組、模型組、酪酸梭菌活菌組、抗帕顆粒組、酪酸梭菌活菌+抗帕顆粒組，每組10只放在一籠，統(tǒng)一在小鼠右耳訂耳標(biāo)，整個(gè)飼養(yǎng)期間飲食飲水不限。在9周齡1 d時(shí)，模型組、酪酸梭菌活菌組、抗帕顆粒組、酪酸梭菌活菌+抗帕顆粒組給予MPTP配制溶液40 mg/(kg·d)腹腔注射，連續(xù)7 d；空白組給予同體積生理鹽水腹腔注射，連續(xù)7 d。建模后第8天開始，酪酸梭菌活菌組給予酪酸梭菌活菌109個(gè)/d灌胃，抗帕顆粒組給予抗帕顆粒40 mg/(kg·d)灌胃，酪酸梭菌活菌+抗帕顆粒組給予酪酸梭菌活菌109個(gè)/d和抗帕顆粒組40 mg/(kg·d)灌胃，模型組和空白組給予0.9%氯化鈉溶液1 mL/d灌胃，均1次/d,連續(xù)4個(gè)月。

1.4實(shí)驗(yàn)取材 灌胃4個(gè)月結(jié)束后每組中隨機(jī)取一半小鼠做腦組織冷凍切片：采用氯胺酮(100 mg/kg)+賽拉嗪(10 mg/kg)進(jìn)行深度麻醉，打開胸腔經(jīng)心臟依次灌注生理鹽水20 mL和多聚甲醛30 mL。灌注完畢后將小鼠斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中4 ℃條件下固定24 h。依次浸入15%，20%，30%蔗糖溶液中4 ℃過夜后，入包埋劑OCT中冰凍包埋。將腦組織切25 μm厚切片，隔5片取1片，入PBS(0.01 mol/L)中-4 ℃保存。每組剩余一半小鼠用3%水合氯醛按照0.01 mL/g劑量腹腔注射麻醉，打開腹腔，在手術(shù)顯微鏡下于食管腹段的前、后壁找出并分離切斷，獲取0.3～0.5 cm迷走神經(jīng)前、后干；顯露后切取中段結(jié)腸約3 cm并多聚甲醛固定24 h，另取約3 cm結(jié)腸標(biāo)本投入液氮，于-80 ℃保存以備檢測。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1結(jié)腸、迷走神經(jīng)、黑質(zhì)組織中α-Syn蛋白表達(dá)檢測 采用免疫印跡(Western blot)法檢測：取上述結(jié)腸、迷走神經(jīng)、黑質(zhì)組織各0.01 g，剪碎后放入勻漿器內(nèi)，加入預(yù)冷的RIPA裂解液混勻，冰上組織裂解30 min后15 000 r/min離心10 min，取上清行蛋白質(zhì)定量測定。在酶標(biāo)板中加入2.5 μL待測蛋白和17.5 μL PBS，加入200 μL BCA工作液振蕩30 s，37 ℃放置30 min，在562 nm下測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白濃度，根據(jù)樣品濃度確定上樣量。蛋白濃度=(樣本OD值的平均值-對照OD值平均值)×斜率。按體積比1∶4加SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，封閉3 h，4 ℃孵育小鼠抗大鼠α-Syn 單克隆抗體(1∶500)過夜，室溫下分別孵育HRP 標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶1 000)及HRP標(biāo)記的羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶1 000)1 h，剝脫液洗膜后以小鼠抗大鼠β-actin 單克隆抗體(1∶500)孵育4 ℃過夜，并以HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶1 000)室溫下孵育1 h；一體式化學(xué)發(fā)光儀拍攝照片，Image J軟件分析條帶吸光度。

1.5.2黑質(zhì)組織中TH、α-Syn 免疫熒光雙染檢測石蠟切片脫蠟回水后微波熱修復(fù)抗原，5% BSA 封閉1 h，同時(shí)加入兔抗大鼠TH 單克隆抗體(1∶2 00)及小鼠抗大鼠α-Syn單克隆抗體(1∶200)，并于4 ℃孵育過夜，羅達(dá)明標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗(1∶100)及FITC標(biāo)記羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶100)，室溫孵育2 h后于熒光顯微鏡下觀察、拍照。TH呈現(xiàn)紅色熒光；α-Syn呈現(xiàn)綠色熒光。每組重復(fù)3次，每張切片取3個(gè)隨機(jī)視野，計(jì)算并統(tǒng)計(jì)平均熒光強(qiáng)度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism8軟件制圖。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，多組間比較使用單因素方差分析，方差非齊性則采用事后比較Dunnett檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠結(jié)腸壁、迷走神經(jīng)、黑質(zhì)組織中α-Syn表達(dá)情況 模型組結(jié)腸、迷走神經(jīng)、黑質(zhì)組織中α-Syn蛋白表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05)；益生菌組、抗帕顆粒組、益生菌+抗帕顆粒組結(jié)腸、迷走神經(jīng)、黑質(zhì)組織中α-Syn蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，抗帕顆粒組和益生菌+抗帕顆粒組結(jié)腸、迷走神經(jīng)、黑質(zhì)組織中α-Syn蛋白表達(dá)量均明顯低于益生菌組(P均<0.05)，且益生菌+抗帕顆粒組結(jié)腸、黑質(zhì)組織中α-Syn蛋白表達(dá)量均明顯低于抗帕顆粒組(P均<0.05)；益生菌+抗帕顆粒組迷走神經(jīng)、黑質(zhì)組織中α-Syn蛋白表達(dá)量與空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1及圖2。

圖1 空白組和帕金森便秘各組小鼠結(jié)腸、迷走神經(jīng)、黑質(zhì)組織中α-Syn相對表達(dá)量

圖2 空白組和帕金森便秘各組小鼠結(jié)腸、迷走神經(jīng)、黒質(zhì)組織中α-Syn表達(dá)條帶

2.2各組小鼠黒質(zhì)組織中TH和α-Syn免疫熒光染色情況 鏡下觀察，模型組TH染色數(shù)量明顯少于空白組(P<0.05)，益生菌組、抗帕顆粒組、益生菌+抗帕顆粒組均明顯多于模型組(P均<0.05)；模型組α-Syn染色數(shù)量明顯多于空白組(P<0.05)，益生菌組、抗帕顆粒組、益生菌+抗帕顆粒組均明顯少于模型組(P均<0.05)。見圖3及圖4。

圖3 空白組和帕金森便秘各組小鼠黒質(zhì)組織中TH和α-Syn免疫熒光染色(×200)

圖4 空白組和帕金森便秘各組小鼠黒質(zhì)組織中TH和α-Syn免疫熒光染色數(shù)量比較

3 討 論

帕金森病主要的病理改變是腦組織內(nèi)α-Syn異常累積伴有黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性壞死，黑質(zhì)殘存神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)路易小體，從而引起運(yùn)動癥狀和非運(yùn)動癥狀[3-4]。2003年Braak提出了著名的腸道起源學(xué)說[5]，并逐漸被各種研究所證實(shí)。Harsanyiova等[6]的一項(xiàng)薈萃分析表明，便秘的發(fā)生可先于帕金森病診斷10年以上。Beck等[7]認(rèn)為腸神經(jīng)叢中出現(xiàn)路易小體，可以解釋帕金森病患者胃腸道動力的減退。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組TH染色數(shù)量明顯少于空白組，α-Syn染色數(shù)量明顯多于空白組，與課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[8]；模型組結(jié)腸、迷走神經(jīng)和大腦黑質(zhì)組織中α-Syn蛋白表達(dá)量均明顯高于空白組，提示α-Syn異常聚集作為帕金森病重要的病理改變同樣存在于腸壁組織、迷走神經(jīng)，也進(jìn)一步證實(shí)了腸道起源學(xué)說。

腸道菌群在帕金森病及其便秘的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，腸道菌群的變化可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，從而觸發(fā)α-Syn的錯(cuò)誤折疊[9],引起腸神經(jīng)內(nèi)α-Syn的分泌，進(jìn)而通過迷走神經(jīng)以類似朊蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)傳遞的方式進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)；另外，腸道菌群還可能通過調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸(SCFA)依賴的基因表達(dá),使α-Syn清除相關(guān)機(jī)制受損，引起α-Syn在腸神經(jīng)系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的沉積[10]。推測改善腸道菌群失衡可抑制帕金森病發(fā)生發(fā)展。Sampath等[11]研究證實(shí)益生菌可抑制帕金森病動物模型胃腸運(yùn)動損傷，改善胃腸動力。故本研究將益生菌作為干預(yù)對照，結(jié)果顯示干預(yù)4個(gè)月后益生菌組結(jié)腸、迷走神經(jīng)、黑質(zhì)組織中α-Syn蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組,尤其是結(jié)腸組織中表達(dá)量更低；大腦黑質(zhì)α-Syn、TH免疫熒光雙染顯示，TH表達(dá)明顯多于模型組，α-Syn表達(dá)明顯少于模型組。說明益生菌干預(yù)可在一定程度上減少或延緩α-Syn在腦腸軸的傳遞，保護(hù)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元，繼而改善帕金森病相關(guān)癥狀，有望成為帕金森病臨床實(shí)踐中的治療選擇。

中醫(yī)認(rèn)為帕金森病屬“顫證”，病位在肝腎，病機(jī)是肝腎不足，治療原則以補(bǔ)腎養(yǎng)肝為主[12]?！鹅`樞·動輸》記載：“胃氣上注于肺……上走空竅，循眼系，入絡(luò)腦。”認(rèn)為胃腸與腦在經(jīng)脈循行上密切相關(guān)。倪光夏等[13]結(jié)合中醫(yī)理論和現(xiàn)代腦腸微生物軸理論，提出“腦神失職”是帕金森病的病因病機(jī)。苗繼文等[14]認(rèn)為脾胃氣機(jī)升降失調(diào)、大腸傳導(dǎo)失職與腸道菌群失調(diào)互為因果。因此，調(diào)節(jié)大腦功能，可通過“腦腸軸”下行途徑影響胃腸功能，恢復(fù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)；調(diào)節(jié)胃腸功能，增加腸道有益菌群，可通過“腦腸軸”上行途徑調(diào)節(jié)腦功能[15]。抗帕顆粒是本課題組早期研制的中藥組方，臨床應(yīng)用顯示能延緩帕金森病進(jìn)展，改善帕金森病的運(yùn)動和非運(yùn)動癥狀[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗帕顆粒組、益生菌+抗帕顆粒組結(jié)腸中α-Syn蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組，且益生菌+抗帕顆粒組最低，說明在改善腸道菌群失調(diào)、阻止α-Syn突破腸黏膜沉積于腸壁方面，益生菌和抗帕顆粒有明顯的協(xié)同作用。在迷走神經(jīng)組織中，抗帕顆粒組、益生菌+抗帕顆粒組α-Syn蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組，與空白組相似，說明在迷走神經(jīng)α-Syn逆?zhèn)鬟f中，抗帕顆粒及與益生菌聯(lián)合應(yīng)用具有更好的阻滯上傳作用。在黑質(zhì)層面，抗帕顆粒組、益生菌+抗帕顆粒組α-Syn蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組，且TH染色數(shù)量增加，α-Syn染色數(shù)量減少，說明抗帕顆粒單用及與益生菌聯(lián)合應(yīng)用均可顯著抑制α-Syn在黑質(zhì)的沉積，均可延緩帕金森病進(jìn)程，但二者聯(lián)合應(yīng)用抑制α-Syn在黑質(zhì)沉積的作用更顯著。

綜上所述，MPTP制作的帕金森病便秘模型小鼠的腸壁、迷走神經(jīng)及大腦黑質(zhì)中α-Syn的表達(dá)增加，而抗帕顆粒和益生菌干預(yù)可阻止α-Syn突破腸黏膜沉積于腸壁神經(jīng)，延緩α-Syn迷走神經(jīng)逆?zhèn)鬟f和黑質(zhì)紋狀體沉積，且二者對減緩α-Syn沿腦腸微生物軸的傳遞有協(xié)同效應(yīng)，相關(guān)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。