陳純靜，趙 澄，張香港，王 平，肖 榮，胡 玨，熊 濤，盧芳國(guó),

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208

2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208

流感相關(guān)腦?。╥nfluenza associated encephalopathy，IAE）是在急性流感過(guò)程中出現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙臨床綜合征，其病情輕重不一，典型臨床表現(xiàn)為急性高熱后突發(fā)驚厥，起病1～2 d內(nèi)（通常在發(fā)熱起病后的24 h內(nèi)）快速進(jìn)展至昏迷或死亡[1]。IAE的發(fā)病機(jī)制迄今尚未闡明，提出的假說(shuō)包括細(xì)胞因子風(fēng)暴學(xué)說(shuō)、病毒直接侵襲腦組織、免疫交叉反應(yīng)等幾個(gè)方面，目前尚無(wú)定論。其中，較為認(rèn)可的一種說(shuō)法是細(xì)胞因子風(fēng)暴學(xué)說(shuō)：機(jī)體在感染流感病毒后釋放促炎癥因子，進(jìn)而誘導(dǎo)了細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴，引發(fā)神經(jīng)及免疫系統(tǒng)功能紊亂和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫病理?yè)p傷，導(dǎo)致IAE的發(fā)生，但其具體機(jī)制有待研究[2]。

麻杏石甘湯源自漢代張仲景《傷寒論·辨太陽(yáng)病脈證并治法》，由麻黃（去節(jié)）4兩（9 g）、杏仁（去皮尖）50個(gè)（9 g）、甘草（灸）2兩（6 g）、石膏（碎、綿裹）半斤（18 g）配伍而成，具有辛涼宣泄、清肺平喘之功效。本課題組前期研究表明，麻杏石甘湯能夠干預(yù)病毒吸附、直接殺傷病毒、抑制病毒增殖，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌、提供免疫保護(hù)、抑制流感病毒感染所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡等方式發(fā)揮抗流感病毒作用[3-8]。本研究以流感病毒肺部感染小鼠模型為研究對(duì)象，從Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）通路研究IAE的發(fā)病機(jī)制，并進(jìn)一步探討麻杏石甘湯的干預(yù)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘）2019-0004，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，恒溫（25±2）℃，恒濕（50±5）%，12 h交替晝夜循環(huán)，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)SYXK（湘）2019-0009。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)小鼠的處理措施已經(jīng)過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為L(zhǎng)L2020092501。

1.2 病毒株

A型流感病毒（influenza A virus，IAV）小鼠肺適應(yīng)株（A/PR/8/34），由湖南師范大學(xué)病毒研究室惠贈(zèng)。經(jīng)10日齡雞胚尿囊腔接種培養(yǎng)傳代，血凝效價(jià)1∶640以上者供實(shí)驗(yàn)用。

1.3 藥材

麻杏石甘湯中的麻黃9 g（批號(hào)2004060）、杏仁9 g（批號(hào)2020120302）、石膏18 g（批號(hào)2008090062）、甘草6 g（批號(hào)201003）均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院戴冰教授鑒定分別為麻黃科植物木賊麻黃Ephedra equisetinaBge.的干燥草質(zhì)莖、薔薇科落葉喬本植物山杏Prunus armeniacaL.var.ansuMaxim.的干燥成熟種子、硫酸鹽類(lèi)礦物硬石膏族石膏、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根及根莖，均符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定。

1.4 藥品與試劑

磷酸奧司他韋膠囊（以?shī)W司他韋計(jì)，75 mg/粒，批號(hào)M1057）由意大利Delpharm Milano S.R.L.生產(chǎn)，上海羅氏制藥有限公司分裝，購(gòu)自中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院門(mén)診藥房，用蒸餾水充分溶解，制成實(shí)驗(yàn)用質(zhì)量濃度為2.165 mg/mL的混懸液；抗病毒顆粒（9 g/袋，批號(hào)2001089）由四川光大制藥有限公司生產(chǎn)，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門(mén)診藥房，用蒸餾水充分溶解，制成實(shí)驗(yàn)用質(zhì)量濃度為0.39 g/mL的溶液；兔抗鼠JAK2抗體（批號(hào)ab39636）、STAT3抗體（批號(hào)ab109085）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；β-actin抗體（批號(hào)0070175）、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（批號(hào)SA00001-2）購(gòu)自Proteintech公司；磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）抗體（批號(hào)AF300993）購(gòu)自艾方生物；RNA simple總RNA提取試劑盒（批號(hào)DP419）購(gòu)自TIANGEN公司；NovoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)E047-01B）、NovoStartSYBR qPCR Super Mixture cDNA擴(kuò)增試劑盒（批號(hào)E096-01A）購(gòu)自Novoprotein公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；小鼠白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-10、IL-4 ELISA試劑盒（批號(hào)E-EL-M0037c、E-EL-M0046c、E-ELM0043c）購(gòu)自Elabscience。

1.5 儀器

BSC-1300 ⅡA2型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；TP-200D型電子分析天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；RMZ135型精密輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；光學(xué)掃描顯微鏡（Axioscope 5）+Axiocam 503 color顯微鏡攝像頭[蔡司科技（蘇州）有限公司]；TGL20M型高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；ELX-800型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；LightCycler96型熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）。

2 方法

2.1 麻杏石甘湯水煎液的制備

根據(jù)《方劑學(xué)》中麻杏石甘湯的藥物組成、劑量、制備方法制備該方水煎液[9]，按其組成比例精確稱(chēng)定麻杏石甘湯1劑的藥材量，加入10倍體積蒸餾水后，浸泡20 min，煮沸后再煎煮30 min，煎煮完畢后濾過(guò)；二煎加入7倍體積蒸餾水煮沸后再煎煮20 min，煎煮完畢后濾過(guò)，合并2次濾液，水浴濃縮至含生藥0.605 g/mL，4 ℃避光保存?zhèn)溆?。本課題組前期通過(guò)水提醇沉淀法對(duì)麻杏石甘湯全方多糖進(jìn)行分離與定性定量測(cè)定[10]，測(cè)定得多糖含量為2.04%；采用超高效液相色譜法對(duì)麻杏石甘湯水煎液3種主要有效成分（麻黃堿、甘草苷、苦杏仁苷）的含量進(jìn)行了檢測(cè)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.10%、0.06%、0.49%。

2.2 分組與給藥

BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)法分別將50只雄鼠和50只雌鼠分為5組，每組10只，各挑選1組隨機(jī)進(jìn)行組合，將小鼠分為對(duì)照組、模型組、奧司他韋（化學(xué)藥對(duì)照）組、抗病毒顆粒（中藥對(duì)照）組和麻杏石甘湯組，每組共20只小鼠（10只雄鼠、10只雌鼠），雌、雄鼠分開(kāi)飼養(yǎng)。除對(duì)照組外，其余動(dòng)物按照本課題前期研究方法建立IAV肺部感染模型[11]。以臨床等效劑量（臨床等效劑量按動(dòng)物每千克體質(zhì)量占人體表面積的比值計(jì)算[12]）的藥物于感染后24 h開(kāi)始ig給藥，每天1次，每次0.2 mL，連續(xù)給藥3、7 d。奧司他韋、抗病毒顆粒、麻杏石甘湯組的給藥劑量分別為21.63 mg/(kg·d)、3.9 g/(kg·d)、6.05 g/(kg·d)。對(duì)照組和模型組ig等體積生理鹽水。

2.3 標(biāo)本采集

分別于給藥治療3、7 d后，禁水禁食8 h后，每組隨機(jī)選取10只小鼠，稱(chēng)定動(dòng)物體質(zhì)量后，摘眼球放血法處死小鼠，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)解剖，稱(chēng)取小鼠全腦質(zhì)量，取部分腦、肺組織置于4%多聚甲醛中固定，部分腦組織置于EP管中，凍存于?80 ℃冰箱備用。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 腦指數(shù) 腦指數(shù)為腦質(zhì)量與體質(zhì)量之比。

2.4.2 肺組織、腦組織病理變化 用4%多聚甲醛固定肺、腦組織，經(jīng)石蠟包埋、切片（5 μm）、二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下（×200）觀察肺、腦組織病理變化。

2.4.3 qRT-PCR法檢測(cè)腦組織中JAK2、STAT3、IL-1β、IL-10和IL-4mRNA的表達(dá) 取出?80 ℃保存的腦組織，按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組樣品的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA做模板，按NovoStartSYBR qPCR Super Mixture試劑說(shuō)明，分別加入β-actin、JAK2、STAT3、IL-1β、IL-10、IL-4引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：JAK2上游引物5’-ACTGGACTATATGTGCTACGA-3’，下游引物5’-GTTCCTCTTAGTCCCGCTGA-3’；STAT3上游引物5’-CAATACCATTGACCTGCCGAT-3’，下游引物5’-GAGCGACTCAAACTGCCCT-3’；IL-1β上游引物5’-TGAAATGCCACCTTTTGACAGT-3’，下游引物5’-TTCTCCACAGCCACAATGAGT-3’；IL-10上游引物5’-GTTCCCCTACTGTCATCCCC-3’，下游引物5’-AGGCAGACAAACAATACACACCA-3’；IL-4上游引物5’-ATGTACCAGGAGCCATATCCACGG-3’，下游引物5’-TCCCTTCTCCTGTGACCTCGTT-3’；β-actin上游引物5’-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3’，下游引物5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’。PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)體系含cDNA 2 μL、NovoStartSYBR qPCR Super Mixture 10 μL、10 μmol/L上下游引物各2 μL，以dd H2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、1 min；95 ℃、20 s，60 ℃、20 s，72 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃、10 s，65 ℃、60 s，97 ℃、1 s繪制熔解曲線(xiàn)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2.4.4 Western blotting法檢測(cè)腦組織中JAK2、STAT3蛋白的表達(dá) 取出?80 ℃保存的腦組織，提取組織總蛋白質(zhì)，應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取40 μg總蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后，封閉處理1 h，分別加入JAK2抗體（1∶1000）、STAT3抗體（1∶2000）、β-actin抗體（1∶10 000），4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，避光顯影。

2.4.5 免疫組化法檢測(cè)腦組織中p-STAT3蛋白表達(dá)取腦組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷，加入3%牛血清白蛋白封閉后滴加p-STAT3抗體（1∶100），4 ℃濕盒中孵育過(guò)夜，加入酶標(biāo)二抗（1∶200）室溫孵育50 min，DAB顯色劑處理5 min，蘇木素復(fù)染3 min，脫水封片，鏡下觀察結(jié)果（×400）。

2.4.6 ELISA法檢測(cè)腦組織IL-1β、IL-10、IL-4水平 取出?80 ℃保存的腦組織，加入PBS及蛋白酶抑制劑進(jìn)行組織勻漿，離心后取上清液，分裝保存，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)腦組織中IL-1β、IL-10、IL-4水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 麻杏石甘湯對(duì)IAV肺炎小鼠腦指數(shù)的影響

如圖1所示，給藥治療3 d后，模型組小鼠腦指數(shù)較對(duì)照組增加（P＜0.01），各給藥組腦指數(shù)較模型組降低（P＜0.05、0.01）；給藥治療7 d后，模型組小鼠腦指數(shù)較對(duì)照組增加（P＜0.05），各給藥組較模型組無(wú)明顯差異。

圖1 麻杏石甘湯對(duì)IAV感染小鼠腦指數(shù)的影響 ( ,n = 10)Fig.1 Effect of Maxing Shigan Decoction on brain index of IAV infected mice ( , n = 10)

3.2 麻杏石甘湯對(duì)IAV肺炎小鼠肺組織、腦組織病理學(xué)的影響

如圖2所示，對(duì)照組小鼠肺組織形態(tài)完整，肺泡腔輪廓清晰，腔內(nèi)無(wú)分泌物，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組肺組織出現(xiàn)明顯病理變化，肺泡塌陷，肺泡腔內(nèi)和肺間質(zhì)中可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，各給藥組肺部炎癥和損傷程度均有所減輕，肺泡腔輪廓較清晰，腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。以上結(jié)果提示，經(jīng)IAV滴鼻感染后，成功建立了小鼠流感病毒肺炎模型。如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠大腦皮質(zhì)出現(xiàn)明顯水腫，水腫部位腦組織結(jié)構(gòu)疏松，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，各給藥組小鼠大腦皮質(zhì)水腫得到改善。如圖4所示，各組小鼠海馬細(xì)胞排列整齊、密集，結(jié)構(gòu)完整，多層分布，偶見(jiàn)細(xì)胞皺縮，染色加深，各組形態(tài)無(wú)明顯差異。如圖5所示，各組小鼠小腦小腦皮質(zhì)層次清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核，細(xì)胞輪廓清晰，排列整齊，偶見(jiàn)浦肯野細(xì)胞層部分細(xì)胞核變形固縮，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，各組形態(tài)無(wú)明顯差異。

圖2 麻杏石甘湯對(duì)各組小鼠肺組織病理學(xué)的影響 (HE, ×200)Fig.2 Effect of Maxing Shigan Decoction on lung histopathology of mice in each group (HE, × 200)

圖3 麻杏石甘湯對(duì)各組小鼠大腦皮質(zhì)組織病理學(xué)的影響 (HE, ×200)Fig.3 Effect of Maxing Shigan Decoction on cerebral cortex histopathology of mice in each group (HE, × 200)

圖4 麻杏石甘湯對(duì)各組小鼠海馬組織病理學(xué)的影響 (HE, ×200)Fig.4 Effect of Maxing Shigan Decoction on hippocampal histopathology of mice in each group (HE, × 200)

圖5 麻杏石甘湯對(duì)各組小鼠小腦病理學(xué)的影響 (HE, ×200)Fig.5 Effect of Maxing Shigan Decoction on cerebellum histopathology of mice in each group (HE, × 200)

3.3 麻杏石甘湯對(duì)IAV肺炎小鼠腦組織中JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)的影響

如圖6所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠腦組織JAK2、STAT3mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，給藥治療3 d后，各給藥組JAK2mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.01），奧司他韋組和麻杏石甘湯組STAT3mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05、0.01）；給藥治療7 d后，抗病毒顆粒組和麻杏石甘湯組JAK2mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05、0.01），抗病毒顆粒組STAT3mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。

圖6 麻杏石甘湯對(duì)各組小鼠腦組織中JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)的影響 ( , n = 3)Fig.6 Effect of Maxing Shigan Decoction on JAK2 and STAT3 mRNA expressions in brain of mice in each group ( , n = 3)

3.4 麻杏石甘湯對(duì)IAV肺炎小鼠腦組織中IL-1β、IL-10、IL-4 mRNA表達(dá)的影響

如圖7所示，與對(duì)照組相比，給藥3 d后模型組小鼠腦組織IL-1βmRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05），IL-10mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.01），給藥7 d后模型組小鼠腦組織IL-4mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.01）；與模型組相比，給藥治療3 d后，各給藥組IL-1βmRNA表達(dá)水平降低（P＜0.01），麻杏石甘湯組IL-10mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.01），各給藥組IL-4mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.01）；給藥治療7 d后，各藥物組IL-1βmRNA表達(dá)水平均降低（P＜0.01），IL-10mRNA表達(dá)水平均升高（P＜0.05、0.01），抗病毒顆粒組IL-4mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。

圖7 麻杏石甘湯對(duì)各組小鼠腦組織中IL-1β、IL-10和IL-4 mRNA表達(dá)的影響 ( , n = 3)Fig.7 Effect of Maxing Shigan Decoction on IL-1β, IL-10 and IL-4 mRNA expressions in brain of mice in each group (,n = 3)

3.5 麻杏石甘湯對(duì)IAV肺炎小鼠腦組織中JAK2、STAT3蛋白表達(dá)的影響

如圖8所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠腦組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05、0.01）；與模型組相比，給藥3 d后，抗病毒顆粒組、麻杏石甘湯組JAK2蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01），奧司他韋組、抗病毒顆粒組STAT3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01）；給藥7 d后，各給藥組JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。

圖8 麻杏石甘湯對(duì)各組小鼠腦組織中JAK2、STAT3蛋白表達(dá)的影響 ( , n = 3)Fig.8 Effect of Maxing Shigan Decoction on JAK2 and STAT3 protein expressions in brain tissue of mice in each group( , n = 3)

3.6 麻杏石甘湯對(duì)IAV肺炎小鼠大腦皮質(zhì)、海馬、小腦中p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

如圖9～12所示，與對(duì)照組相比，模型組大腦皮質(zhì)p-STAT3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，各給藥組大腦皮質(zhì)p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01），各組小鼠海馬及小腦組織中p-STAT3蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異。

圖10 各組小鼠海馬p-STAT3蛋白表達(dá)的免疫組化圖 (×400)Fig.10 Immunohistochemical staining graph of p-STAT3 protein expression in hippocampus of mice in each group (× 400)

圖11 各組小鼠小腦p-STAT3蛋白表達(dá)的免疫組化圖 (×400)Fig.11 Immunohistochemical staining graph of p-STAT3 protein expression in cerebellum of mice in each group (× 400)

圖12 麻杏石甘湯對(duì)各組小鼠大腦皮質(zhì)、海馬和小腦p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 (, n = 3)Fig.12 Effect of Maxing Shigan Decoction on p-STAT3 protein expression in cerebral cortex, hippocampus and cerebellum of mice in each group ( , n = 3)

3.7 麻杏石甘湯對(duì)IAV肺炎小鼠腦組織中IL-1β、IL-10、IL-4水平的影響

如圖13所示，與對(duì)照組相比，給藥3 d后模型組腦組織勻漿中IL-1β水平升高（P＜0.01），IL-10及IL-4水平降低（P＜0.01），給藥7 d后模型組腦組織勻漿中IL-1β、IL-10、IL-4水平均升高（P＜0.05、0.01）。與模型組相比，給藥治療3 d后，奧司他韋組IL-1β水平升高（P＜0.05），抗病毒顆粒組和麻杏石甘湯組IL-1β水平降低（P＜0.01），各藥物組IL-10及IL-4水平均升高（P＜0.01）；給藥7 d后，各給藥組IL-1β水平均降低（P＜0.05、0.01），IL-10和IL-4水平均升高（P＜0.05、0.01）。

圖13 麻杏石甘湯對(duì)各組小鼠腦組織中IL-1β、IL-10和IL-4水平的影響 ( , n = 3)Fig.13 Effect of Maxing Shigan Decoction on levels of IL-1β, IL-10 and IL-4 in brain of mice in each group ( , n = 3)

4 討論

根據(jù)流感的癥狀特點(diǎn)，可將其分為4種類(lèi)型：?jiǎn)渭冃土鞲小⒎窝仔土鞲?、胃腸型流感以及中毒型流感。其中，中毒型流感見(jiàn)于少數(shù)有基礎(chǔ)性疾病、免疫力較差的患者。這些患者病情持續(xù)惡化，進(jìn)展為重癥肺炎，繼發(fā)急性呼吸窘迫綜合征及膿毒性休克，累及多個(gè)器官，例如神經(jīng)系統(tǒng)損傷、心臟損害、肌炎、橫紋肌溶解綜合征等[13]。流感導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)損傷包括腦炎、腦膜炎、脊髓炎、吉蘭-巴雷綜合征、IAE等[14]。IAE是指在急性流感過(guò)程中伴隨中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的一種臨床綜合征，引起IAE的流感病毒以甲型流感病毒尤其是H1N1、H3N2最常見(jiàn)，此外，乙型流感病毒感染也可導(dǎo)致IAE的發(fā)生[15-16]。北京兒童醫(yī)院報(bào)道IAE引起的患兒死亡占流感死亡患兒的36.84%?；純簭陌l(fā)病到死亡平均3 d[17]。目前關(guān)于IAE的發(fā)生機(jī)制并不十分明確。有研究認(rèn)為是由于病毒直接入侵神經(jīng)系統(tǒng)，通過(guò)復(fù)制導(dǎo)致其功能障礙，但是多數(shù)臨床報(bào)道IAE患者的腦脊液或尸檢腦組織中流感病毒檢出率低，甚至腦組織檢測(cè)不到病毒抗原或病毒RNA[18-20]，意味著病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中未復(fù)制或者沒(méi)有足夠數(shù)量的復(fù)制，或在取樣前病毒已經(jīng)被清除[21-23]。還有研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染后激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，機(jī)體與病毒抗原存在交叉抗原，從而導(dǎo)致器官損傷。而更為認(rèn)可的一種說(shuō)法是細(xì)胞因子風(fēng)暴學(xué)說(shuō)：由于病毒感染，患者血清中促炎癥細(xì)胞因子水平增高，造成全身炎癥反應(yīng)綜合征，引起膿毒血癥，這些細(xì)胞因子可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，血腦屏障受損，細(xì)胞因子可進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，同時(shí)刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放更多的細(xì)胞因子，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)功能[2]。

本研究建立了小鼠流感病毒肺部感染模型，通過(guò)檢測(cè)小鼠腦組織病理變化及相關(guān)信號(hào)通路蛋白、細(xì)胞因子的表達(dá)水平，初步探索IAE的發(fā)病機(jī)制。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯病理變化，提示肺炎模型構(gòu)建成功，且模型組小鼠腦指數(shù)增加，大腦皮質(zhì)出現(xiàn)明顯水腫，水腫部位腦組織結(jié)構(gòu)疏松，但未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。流感病毒感染機(jī)體后，激活各種天然免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)多種炎癥因子及趨化因子的分泌，這些因子在感染早期主要介導(dǎo)抗病毒免疫反應(yīng)，在持續(xù)感染或重癥感染時(shí)，相關(guān)信號(hào)通路激活，其下游產(chǎn)物可進(jìn)一步介導(dǎo)各種炎癥因子的釋放，引起免疫紊亂，炎癥因子失衡，發(fā)生細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重者并發(fā)多器官功能障礙綜合征，甚至死亡。目前，細(xì)胞因子風(fēng)暴被認(rèn)為是IAE的主要發(fā)病機(jī)制。JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是多種細(xì)胞因子發(fā)揮作用的重要信號(hào)通路之一，與“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的發(fā)生密切相關(guān)[24-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組小鼠腦組織中JAK2、STAT3基因及蛋白表達(dá)水平升高，STAT家族位于JAKs的下游，激活的JAKs可使STAT發(fā)生磷酸化，從而形成二聚體入核，發(fā)揮相應(yīng)的作用。因此，本研究還檢測(cè)了腦組織磷酸化STAT3的表達(dá)水平，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組大腦皮質(zhì)p-STAT3表達(dá)水平均增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，經(jīng)流感病毒肺部感染后，小鼠腦組織JAK2/STAT3信號(hào)通路被激活。同時(shí)，本研究還檢測(cè)了腦組織中細(xì)胞因子IL-1β、IL-10、IL-4基因表達(dá)及分泌水平，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，模型組均存在不同程度變化，說(shuō)明模型組小鼠腦組織中炎癥因子表達(dá)紊亂。綜上所述，本研究結(jié)果提示，流感病毒肺部感染后，機(jī)體腦組織發(fā)生病理?yè)p傷，其機(jī)制可能是由腦組織中JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活及炎癥因子的失衡所介導(dǎo)的。本研究結(jié)果為IAE的發(fā)病機(jī)制提供了一定的思路及啟發(fā)。

中藥治療流感有著悠久的歷史。麻杏石甘湯是臨床上治療流感的常用基礎(chǔ)方劑之一，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的2018—2020年《流行性感冒診療方案》中，均將該方作為基礎(chǔ)方用于流感熱毒襲肺證的辯證治療[14,28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予臨床等效劑量麻杏石甘湯治療后，與模型組相比，小鼠肺、腦組織病理?yè)p傷減輕，腦指數(shù)下降，腦水腫緩解，同時(shí)JAK2、STAT3基因及蛋白表達(dá)水平均降低，p-STAT3表達(dá)水平降低，IL-1β、IL-10、IL-4紊亂相對(duì)恢復(fù)平衡，提示該方可緩解流感病毒肺炎模型小鼠腦組織的損傷，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腦組織中JAK2/STAT3信號(hào)通路及炎癥因子失衡。本研究為麻杏石甘湯治療流感相關(guān)性疾病提供了實(shí)驗(yàn)支持及科學(xué)依據(jù)，但麻杏石甘湯的藥效成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)多樣，后續(xù)將通過(guò)質(zhì)譜等技術(shù)手段，對(duì)麻杏石甘湯中的藥效物質(zhì)進(jìn)行解析，并結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探索其抗流感病毒效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究尚存在諸多不足，例如在對(duì)腦組織中各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，選取的是全腦，而病理檢測(cè)及p-STAT3檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組腦組織的損傷及p-STAT3的表達(dá)變化主要集中在大腦皮質(zhì)，后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行分區(qū)分離，對(duì)不同區(qū)域的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突