孫英輝 ，尚?；ǎ刃⊙? ，武衛(wèi)黨 , ，王 澤，崔 濤 , ，曾 勇, ，閆鳳英 , ，伊秀林 ,

1.天津藥物研究院有限公司 生物技術(shù)中心，天津 300301

2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物代謝新技術(shù)創(chuàng)新單元，天津 300301

3.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院&中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192

4.天津和創(chuàng)生物技術(shù)有限公司，天津 300301

5.天津藥物研究院有限公司 釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300301

6.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 301617

銀膠菊屬銀膠菊Parthenium hysterophorusL.是一年生草本，具主根，徑直立，葉變化多樣，頭狀花序小，放射狀。民間多用銀膠菊治療偏頭痛、風(fēng)濕病等。銀膠菊的乙醇提取物經(jīng)萃取分離得到小白菊內(nèi)酯。小白菊內(nèi)酯（圖1-A）是一種倍半萜烯內(nèi)酯類(lèi)（sesquiterpene lactones，SLs）化合物[1]。研究表明，小白菊內(nèi)酯具有明顯的抗腫瘤作用，對(duì)惡性膠質(zhì)瘤、急性髓細(xì)胞白血病 、前列腺癌等多種癌癥具有治療作用[2-4]。然而，小白菊內(nèi)酯水溶性較差，限制了其臨床研究和應(yīng)用。小白菊內(nèi)酯衍生物ACT001（圖1-B）為11βH,13-二甲基氨基含笑內(nèi)酯的富馬酸鹽，母核為愈創(chuàng)木烷型倍半萜烯內(nèi)酯。ACT001是一個(gè)抗腫瘤高活性化合物，現(xiàn)作為抗腦膠質(zhì)瘤I類(lèi)新藥正在進(jìn)行臨床研究階段[5-7]。腦膠質(zhì)瘤是膠質(zhì)瘤的最?lèi)盒宰凅w，約占所有固有腦瘤的一半。當(dāng)前的治療方案為切除、放射治療合并化學(xué)治療[8-11]。但是，膠質(zhì)瘤是浸潤(rùn)式生長(zhǎng)的，手術(shù)很難完全切除，迫切需要一種安全有效的藥物來(lái)治療腦膠質(zhì)瘤。因此，ACT001作為抗腦膠質(zhì)瘤I類(lèi)新藥具有明顯的臨床價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

圖1 小白菊內(nèi)酯 (A) 和ACT001 (B) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of parthenolide (A) and ACT001 (B)

藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體是一類(lèi)存在于細(xì)胞膜上對(duì)藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用的膜蛋白，可分為攝入型轉(zhuǎn)運(yùn)體和外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體。攝入型轉(zhuǎn)運(yùn)體主要包括有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（organic cation transporters，OCTs）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（organic anion transporters，OATs）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（organic anion transport peptides，OATPs）等；外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體以P糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp，又名MDR1）和乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）為代表[12-13]。外排轉(zhuǎn)運(yùn)體在血腦屏障、腸上皮細(xì)胞壁膜、肝和腎小管細(xì)胞中高表達(dá)，可調(diào)節(jié)藥物的吸收、分布和排泄等藥動(dòng)學(xué)過(guò)程[14-15]，且與抗腫瘤藥物的耐藥性密切相關(guān)。

小白菊內(nèi)酯衍生物ACT001作為抗腦膠質(zhì)瘤I類(lèi)新藥，目前尚未報(bào)道其與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體作用的關(guān)系。本研究應(yīng)用人藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞/囊泡、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco-2、LS-180），較為全面地研究了ACT001對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制作用、底物親和性和誘導(dǎo)作用，從藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體角度闡明了ACT001的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及可能發(fā)生的藥物-藥物相互作用和耐藥性。

1 材料

1.1 藥品與試劑

ACT001（批號(hào)20120704，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）購(gòu)自尚德藥緣科技有限公司；14C-氨基馬尿酸（批號(hào)1558673）、3H-硫酸雌酮（批號(hào)140331）、3H-地高辛（批號(hào)160624）、14C-溴化四乙胺（批號(hào)130311）、3H-?；悄懰幔ㄅ?hào)140403）購(gòu)自美國(guó)ARC公司；UTIMA Gold閃爍液（批號(hào)77-15481）購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司；奎尼?。ㄅ?hào)10138583，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；丙磺舒（批號(hào)15327，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、利福平（批號(hào)11246，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、維拉帕米（批號(hào)18578，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、BCRP抑制劑Ko143（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）購(gòu)自美國(guó)MCE公司；異甘草素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購(gòu)自國(guó)家藥品和生物制品控制研究所；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)8117283）、胎牛血清（批號(hào)1912660C）、0.25%胰酶-EDTA（批號(hào)1919590）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；100×青鏈霉素混合液（批號(hào)20180624）、PBS緩沖液（批號(hào)P1010）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)520C032）、DEPC水購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Transwell?12孔聚碳酸酯膜轉(zhuǎn)運(yùn)板（批號(hào)20917020）購(gòu)自美國(guó)Corning公司；P-gp抗體、BCRP抗體購(gòu)自ABclonal Technology公司；β-actin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Abkkine公司；TRNzol Reagent購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量試劑盒購(gòu)自Roche公司；MTS細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天津厚普生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 儀器

CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；BS124S型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；CO2培養(yǎng)箱、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、Varioskan Flash酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Tri-Carb 2910 TR型放射性液體閃爍儀（美國(guó)PerkinElmer公司）；FLE712AA型多孔濾器（日本Advantec公司）；Millcell ERS-2型跨上皮電阻儀（美國(guó)Millipore公司）；ZHWY型上海智誠(chéng)恒溫振蕩器（北京華威興業(yè)科技有限公司）；LCMS-8060型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司）；Life ECO PCR基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司）；Mastercycler ep Realplex2qRT-PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.3 細(xì)胞株

藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體過(guò)表達(dá)單克隆細(xì)胞株MDCKOAT1、S2-OAT3、HEK293-OATP1B1、HEK293-OATP1B3、S2-OCT1、S2-OCT2、MDCK-MDR1及空白載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞（MDCK-Mock、S2-Mock、HEK293-Mock）均由日本富士生物醫(yī)藥研究所贈(zèng)予；BCRP/膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）/mock基因表達(dá) inside-out vesicles購(gòu)自日本GenoMembrane公司；Caco-2細(xì)胞及LS-180細(xì)胞購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

所有細(xì)胞系均于培養(yǎng)皿內(nèi)，用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃（S2細(xì)胞在33 ℃）、5% CO2和相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)，用胰酶消化成細(xì)胞懸液。本實(shí)驗(yàn)所用的Caco-2細(xì)胞為35～38代，LS-180細(xì)胞為26～30代，MDCK-MDR1細(xì)胞為25～28代、MDCK-BCRP細(xì)胞為26～29代，轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞為26～35代。

2.2 MTS測(cè)試

將MDCK細(xì)胞（2.5×104/mL）、HEK293細(xì)胞（8×104/mL）、S2細(xì)胞（8×104/mL）、Caco-2細(xì)胞（5×104/mL）、LS-180細(xì)胞（5×104/mL）分別接種于96孔板中培養(yǎng)24 h后，加入新鮮培養(yǎng)基配制系列濃度為1～100 μmol/L的ACT001的含藥培養(yǎng)基孵育48 h。隨后加入MTS溶液孵育，每隔一定時(shí)間取出，采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在492 nm處的吸光度（A）值。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）使用GraphPad Prism軟件計(jì)算。

2.3 ACT001對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制作用

2.3.1 攝入轉(zhuǎn)運(yùn)體 將細(xì)胞懸液用培養(yǎng)基稀釋至1.5×105/mL接種至24孔板（OATP1B1、OATP1B3基因表達(dá)細(xì)胞接種于D-聚賴(lài)氨酸包被的24孔板）培養(yǎng)至各孔細(xì)胞長(zhǎng)滿。將24孔板置于37 ℃水浴中移去培養(yǎng)液，添加37 ℃緩沖液孵育10 min后移去緩沖液，添加含放射性標(biāo)記的探針底物和各濃度ACT001（0.3～100 μmol/L）的混合溶液，在設(shè)定時(shí)間移去探針底物溶液，加入1 mL冰浴緩沖液終止反應(yīng)。各轉(zhuǎn)運(yùn)體的放標(biāo)底物及濃度、陽(yáng)性抑制劑及濃度和給藥時(shí)間見(jiàn)表1，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。每孔添加0.1 mmol/L NaOH裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至EP管中，加入閃爍液，用閃爍儀測(cè)定樣品中的放射性強(qiáng)度。

表1 各轉(zhuǎn)運(yùn)體給藥實(shí)驗(yàn)條件Table 1 Test conditions for each transporter administration

2.3.2 外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp 取MDCK-MDR1細(xì)胞懸液調(diào)整密度至1×105/mL，接種于Transwell 12孔板中，在細(xì)胞層頂端（AP）每孔加0.5 mL細(xì)胞懸液，基底端（BL）每孔加1.5 mL新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)6 d，得到完全分化的細(xì)胞單層。棄去Transwell小室兩端的培養(yǎng)基，在兩側(cè)均按比例加入37 ℃預(yù)熱的HBSS溶液，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中平衡20 min；棄去HBSS，在BL加入1.5 mL預(yù)熱的添加含3H-地高辛和各濃度ACT001（0.3～100 μmol/L）的HBSS溶液，在AP加入預(yù)熱的0.5 mL空白HBSS溶液；置于37 ℃振蕩器孵育15 min；取100 μL細(xì)胞AP的轉(zhuǎn)運(yùn)液加入閃爍液，充分混勻后測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)液中的3H-地高辛濃度。

2.3.3 外排轉(zhuǎn)運(yùn)體BCRP、BSEP ACT001對(duì)2種轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制作用通過(guò)囊泡實(shí)驗(yàn)測(cè)定。分別配制2種轉(zhuǎn)運(yùn)體所用緩沖液和反應(yīng)體系后，將inside-out vesicle放置于37 ℃水浴孵育5 min，加入混合液反應(yīng)5 min后加終止液終止反應(yīng)。將反應(yīng)液和終止液混合置于濾膜上濾掉液體并用冰緩沖液清洗后取下濾膜，轉(zhuǎn)移至EP管中，加入閃爍液，用閃爍儀測(cè)定樣品中的放射性強(qiáng)度。放射性標(biāo)記底物、陽(yáng)性抑制劑、給藥時(shí)間見(jiàn)表1。

計(jì)算抑制率，以抑制率代表抑制作用強(qiáng)度。使用Prism 5.0軟件計(jì)算ACT001抑制各轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)活性的IC50。各數(shù)值間的差異性分析采用t檢驗(yàn)。

抑制率＝(U-U0)/(Uc-U0)Uc表示對(duì)照組的DPM（每分鐘衰變數(shù)）值，U0表示Mock細(xì)胞的DPM值，U表示各給藥組的DPM值

2.4 LC-MS/MS檢測(cè)

2.4.1 色譜條件 Acquity UPLC?BEH C8色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為甲醇-乙腈（1∶1），流動(dòng)相B為5 mmol/L甲酸胺-10%甲醇水溶液，梯度洗脫：0～3 min，90% B；3～4 min，90%～10% B；4～5 min，10%～90% B；1.5～2.8 min切入質(zhì)譜儀。體積流量為0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫40 ℃；內(nèi)標(biāo)（IS）為吲達(dá)帕胺。

2.4.2 質(zhì)譜條件 ESI離子源，正離子模式；霧化氣體積流量為3 L/min；加熱氣體積流量為10 L/min；接口溫度為300 ℃；去溶劑氣溫度為250 ℃；熱塊溫度為400 ℃；干燥氣體積流量為10 L/min；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）。

2.4.3 樣品處理 配制梯度標(biāo)曲及質(zhì)控樣品，線性范圍為0.5～25 μmol/L（用50%甲醇溶液配制）。取50 μL 50% Hanks液，分別加入50 μL甲醇和50 μL內(nèi)標(biāo)溶液（含1 μg/mL吲達(dá)帕胺的甲醇溶液），再加入50 μL標(biāo)液/樣品，渦旋1 min；取出50 μL溶液，分別加入450 μL 50%甲醇稀釋?zhuān)瑴u旋混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；再取100 μL溶液于內(nèi)插管中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)樣2 μL，進(jìn)行LC-MS/MS定量分析。

2.4.4 方法學(xué)驗(yàn)證 ACT001的LC-MS/MS定量分析方法經(jīng)過(guò)了完整的方法學(xué)驗(yàn)證，在該分析方法下，細(xì)胞中的其余物質(zhì)不會(huì)干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，ACT001的線性范圍為0.5～25.0 μmol/L，ACT001保留時(shí)間為2.13 min。配制低、中、高濃度（0.5、10、50 μmol/L）的ACT001溶液，分別測(cè)定化合物的穩(wěn)定性、方法的準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果顯示，ACT001穩(wěn)定性的RSD＜15%，精密度的RSD為4.9%，準(zhǔn)確度的RSD為5.7%。

2.5 底物研究

取Caco-2細(xì)胞懸液調(diào)整密度至2×105/mL接種于Transwell 12孔板中。連續(xù)培養(yǎng)21 d，得到完全分化的細(xì)胞單層。棄去Transwell舊培養(yǎng)基，加入37 ℃預(yù)熱的HBSS溶液平衡20 min；取出板子后，在細(xì)胞AP加入0.5 mL預(yù)熱的含有ACT001的HBSS溶液，BL加入1.5 mL預(yù)熱的HBSS，以此檢測(cè)細(xì)胞AP到BL的轉(zhuǎn)運(yùn)；在細(xì)胞AP加入0.5 mL預(yù)熱的HBSS，BL加入1.5 mL預(yù)熱的含有ACT001的HBSS溶液檢測(cè)BL到AP的轉(zhuǎn)運(yùn)。37 ℃恒溫振蕩器孵育15 min后吸取轉(zhuǎn)運(yùn)液，測(cè)定其中ACT001濃度。在檢測(cè)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP抑制劑Ko143（5 μmol/L）對(duì)ACT001在MDCK-BCRP/Caco-2細(xì)胞單層上轉(zhuǎn)運(yùn)的影響和P-gp抑制劑維拉帕米（30 μmol/L）對(duì)ACT001在MDCK-MDR1/Caco-2細(xì)胞單層上轉(zhuǎn)運(yùn)的影響時(shí)，用同時(shí)含有抑制劑和藥物的給藥液代替只含藥物的給藥液即可。ACT001的給藥濃度為3、30 μmol/L。每個(gè)濃度重復(fù)3次。用LCMS/MS測(cè)定ACT001在轉(zhuǎn)運(yùn)液中的濃度。

以表觀滲透系數(shù)（apparent permeation coefficient，Papp）的大小反映藥物透過(guò)單層細(xì)胞的能力以及藥物吸收的速度。

Papp＝V×(dC/dt)×1/A×1/C0

V表示接收室的溶液體積（AP端為0.5 cm3、BL端為1.5 cm3），A表示膜的面積（1.13 cm2），C0表示藥物的起始濃度，dC/dt表示接收室在單位時(shí)間獲得的藥物濃度，即接收室的最終濃度除以轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間

以外排率（efflux ratio，RE）代表藥物外排能力的大小，通過(guò)RE可以預(yù)測(cè)藥物在腸吸收是否存在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的外排或攝入。

RE＝Papp(B-A)/Papp(A-B)

A-B代表AP→BL，B-A代表BL→AP，當(dāng)所測(cè)藥物的RE≥2時(shí)，表示藥物可能為腸道外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物，當(dāng)所測(cè)藥物的RE≤0.5時(shí)，表示該藥物可能為腸道攝入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物

2.6 誘導(dǎo)研究

LS-180細(xì)胞以1.5×105/mL接種于24孔板中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入1 mL含誘導(dǎo)劑和待測(cè)藥的培養(yǎng)基。其中分為空白組：含0.1% DMSO的培養(yǎng)基；陽(yáng)性藥組：分別為含10 μmol/L利福平、1 μmol/L異甘草素的培養(yǎng)基；給藥組：含3、10、20 μmol/L ACT001的培養(yǎng)基；每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。每24小時(shí)更換1次相同的培養(yǎng)基，設(shè)置不同誘導(dǎo)時(shí)間組，細(xì)胞與誘導(dǎo)劑作用時(shí)間分別為48、72、96 h。誘導(dǎo)完成后用TRNzol總RNA提取試劑處理細(xì)胞，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用qRT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，qRT-PCR反應(yīng)體系為Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）12.5 μL、上游引物（10 μmol/L）0.75 μL、下游引物（10 μmol/L）0.75 μL、水9 μL、cDNA模板2 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)，60～95 ℃熔解曲線分析。引物序列見(jiàn)表2。采用2?ΔΔCt法，測(cè)定樣品中P-gp、BCRP目的基因和β-actin內(nèi)參基因的Ct值，計(jì)算給藥組細(xì)胞基因與空白組細(xì)胞基因相比較的表達(dá)倍數(shù)。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

另取誘導(dǎo)完成后的樣品用RIPA試劑處理提取總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白后進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。使用Gel-Pro Analyzer 4軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析；使用GraphPad Prism 5軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行繪制柱形圖。

3 結(jié)果

3.1 MTS檢測(cè)

MTS實(shí)驗(yàn)考察化合物對(duì)細(xì)胞的毒性作用，LS-180細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ACT001對(duì)LS-180細(xì)胞的IC50大于40 μmol/L；以相同的方法處理實(shí)驗(yàn)使用的其他細(xì)胞，結(jié)果表明ACT001對(duì)Caco-2、S2、MDCK和HEK293細(xì)胞的IC50均大于100 μmol/L，說(shuō)明本研究所使用的濃度在細(xì)胞安全合理范圍內(nèi)，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性。

3.2 ACT001對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制作用研究

轉(zhuǎn)運(yùn)活性抑制實(shí)驗(yàn)中ACT001的給藥濃度為0.3～100 μmol/L，結(jié)果見(jiàn)圖2，ACT001對(duì)OAT1介導(dǎo)的14C-氨基馬尿酸、OAT3介導(dǎo)的3H-硫酸雌酮、OCT1介導(dǎo)的14C-溴化四乙胺、OCT2介導(dǎo)的14C-溴化四乙胺、OATP1B1介導(dǎo)的3H-硫酸雌酮、P-gp介導(dǎo)的3H-地高辛、BSEP介導(dǎo)的3H-?；悄懰岬霓D(zhuǎn)運(yùn)活性無(wú)影響或影響較弱，IC50均大于100 μmol/L；對(duì)BCRP介導(dǎo)的3H-硫酸雌酮轉(zhuǎn)運(yùn)活性有明顯抑制作用，即對(duì)BCRP的轉(zhuǎn)運(yùn)活性有顯著影響，IC50為48.6 μmol/L。

圖2 ACT001對(duì)臨床關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制作用 ( , n = 3)Fig.2 Inhibitory effect of ACT001 on clinical key transporters ( , n = 3)

3.3 底物研究

預(yù)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30 μmol/L ACT001給藥15 min時(shí)Papp值最佳。如表3所示，ACT001在30 μmol/L濃度下，攝入方向的Papp值為2～4，有外排現(xiàn)象，添加BCRP抑制劑Ko143后外排被明顯抑制。

表3 ACT001在Caco-2、MDCK-BCRP和MDCK-MDR1細(xì)胞中雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp值和RE值 ( , n = 3)Table 3 Papp and RE of ACT001 bi-directional transport in Caco-2, MDCK-BCRP and MDCK- MDR1 cell (, n = 3)

表3 ACT001在Caco-2、MDCK-BCRP和MDCK-MDR1細(xì)胞中雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp值和RE值 ( , n = 3)Table 3 Papp and RE of ACT001 bi-directional transport in Caco-2, MDCK-BCRP and MDCK- MDR1 cell (, n = 3)

細(xì)胞 組別 濃度/(μmol·L?1) Papp/(×10?6 cm·s?1) RE AP→BL AP→BL Caco-2 ACT001 30 1.08±0.33 3.18±0.64 2.95 ACT001+Ko143 30 1.17±0.64 0.94±0.07 0.80 ACT001+維拉帕米 30 1.10±0.07 2.67±0.02 2.43 MDCK-BCRP ACT001 30 4.40±3.28 30.13±10.40 6.84 ACT001+Ko143 30 24.72±6.12 43.90±18.72 1.78 MDCK-MDR1 ACT001 30 30.42±7.09 22.57±3.01 0.74 ACT001+維拉帕米 30 39.40±6.73 40.14±5.38 1.02

以上數(shù)據(jù)說(shuō)明ACT001在Caco-2細(xì)胞中跨膜能力中等，存在外排轉(zhuǎn)運(yùn)體BCRP參與的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，在較高濃度時(shí)外排更強(qiáng)，且加入BCRP抑制劑后ACT001的跨膜能力達(dá)到良好。在MDCK-BCRP細(xì)胞中，ACT001在30 μmol/L濃度下給藥，攝入方向的Papp值隨著給藥濃度的增大而降低，在30 μmol/L濃度下，外排現(xiàn)象明顯，添加BCRP抑制劑Ko143后外排被明顯抑制；在MDCK-MDR1細(xì)胞中，ACT001沒(méi)有表現(xiàn)出外排現(xiàn)象，添加P-gp抑制劑也不產(chǎn)生影響。說(shuō)明ACT001為外排轉(zhuǎn)運(yùn)體BCRP的底物。

3.4 誘導(dǎo)研究

如圖3所示，ACT001孵育72 h可不同程度地上調(diào)LS-180細(xì)胞外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp、BCRP的mRNA表達(dá)水平，誘導(dǎo)96 h及以上會(huì)造成LS-180細(xì)胞的脫落，因此本研究只討論誘導(dǎo)72 h時(shí)的結(jié)果。

圖3 ACT001對(duì)LS-180細(xì)胞P-gp和BCRP mRNA表達(dá)的影響 ( , n = 3)Fig.3 Effect of ACT001 on P-gp and BCRP mRNA expressions in LS-180 cells ( , n = 3)

利福平作為常用的P-gp誘導(dǎo)劑，對(duì)P-gp的誘導(dǎo)作用顯著，誘導(dǎo)倍數(shù)達(dá)到26.2倍。10 μmol/L的ACT001孵育72 h可分別上調(diào)P-gp和BCRP的mRNA表達(dá)水平8.98、8.21倍，而3、20 μmol/L的ACT001孵育72 h可使P-gpmRNA表達(dá)水平上調(diào)3.28、1.66倍；相同條件下，使BCRPmRNA表達(dá)水平上調(diào)2.43、1.54倍。蛋白誘導(dǎo)結(jié)果見(jiàn)圖4，3、10、20 μmol/L的ACT001使P-gp蛋白表達(dá)水平分別上調(diào)3.06、3.76、1.44倍；相同條件下，使BCRP蛋白表達(dá)水平分別上調(diào)3.95、2.92、0.26倍。

圖4 ACT001對(duì)LS-180細(xì)胞P-gp和BCRP蛋白表達(dá)的影響 ( , n = 3)Fig.4 Effect of ACT001 on P-gp and BCRP protein expressions in LS-180 cells ( , n = 3)

4 討論

Caco-2細(xì)胞系來(lái)源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，同源性好，在體外培養(yǎng)條件可自發(fā)進(jìn)行腸道上皮樣分化形成微絨毛結(jié)構(gòu)，生成細(xì)胞間緊密連接蛋白，且表達(dá)各種蛋白載體和酶，與小腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)類(lèi)似[16]。應(yīng)用Caco-2細(xì)胞模型得到的數(shù)據(jù)與體內(nèi)數(shù)據(jù)基本一致，條件可控，重復(fù)性好，且相比于動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)成本低，國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力和跨膜轉(zhuǎn)膜機(jī)制進(jìn)行評(píng)價(jià)。與Caco-2細(xì)胞模型相比，LS-180細(xì)胞模型中參與外排轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)調(diào)控過(guò)程的人孕烷受體（pregnane X receptor，PXR）和類(lèi)固醇外源異物受體（steroid and xenobiotic receptor，SXR）表達(dá)水平較高[17-18]，因此誘導(dǎo)效果更為顯著，是轉(zhuǎn)運(yùn)體體外細(xì)胞誘導(dǎo)試驗(yàn)中的常見(jiàn)模型[19]。

腦膠質(zhì)瘤具有很高的發(fā)病率和死亡率。ACT001是針對(duì)膠質(zhì)瘤的I類(lèi)新藥，具有明顯的臨床價(jià)值。先前文獻(xiàn)報(bào)道大鼠組織分布研究中在腦組織檢測(cè)到ACT001的存在，但本研究首次證明ACT001是BCRP的底物，BCRP在血腦屏障和腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[20-21]，ACT001雖跨膜能力良好，但因是BCRP的底物，可被外排導(dǎo)致其生物利用度受到影響。

前期研究基于ACT001的結(jié)構(gòu)特征和PBPK/PD模擬結(jié)果顯示ACT001具有較高的血腦屏障滲透性，并未報(bào)道ACT001與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的具體作用關(guān)系。本研究首次從轉(zhuǎn)運(yùn)體角度證明ACT001是BCRP的底物以及BCRP和P-gp的誘導(dǎo)劑。BCRP和P-gp在血腦屏障中高表達(dá)，因此，ACT001在實(shí)際應(yīng)用中可能會(huì)因BCRP和P-gp的外排作用而使藥效受到一定影響。

ACT001的臨床前藥動(dòng)學(xué)研究表明，大鼠（雄鼠）單次poACT001（20、100、500 mg/kg）體內(nèi)血藥濃度分別可以達(dá)到約5、25、50 μmol/L[22]，因此本研究選擇3、10、20 μmol/L 3個(gè)濃度作為底物研究和誘導(dǎo)作用研究的給藥濃度，不會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖造成影響；該研究結(jié)果對(duì)ACT001的實(shí)際臨床應(yīng)用具有參考價(jià)值。

本研究表明，ACT001對(duì)P-gp和BCRP蛋白具有誘導(dǎo)表達(dá)的作用，P-gp、BCRP二者與代謝酶具有較高的底物重疊率，對(duì)P-gp和BCRP表達(dá)水平產(chǎn)生誘導(dǎo)時(shí)，由于競(jìng)爭(zhēng)和誘導(dǎo)作用，極有可能會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝酶[23-24]介導(dǎo)的藥物-藥物相互作用[25-27]，這為正確理解ACT001可能存在的藥物相互作用提供了新的思路。另外，腫瘤細(xì)胞中P-gp和BCRP過(guò)表達(dá)會(huì)使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果不理想。提示ACT001在臨床上應(yīng)與BCRP抑制劑聯(lián)合使用，這可能會(huì)增加ACT001在腦組織和腫瘤細(xì)胞內(nèi)的暴露量，從而提高療效。本研究為ACT001與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的關(guān)聯(lián)提供了新的見(jiàn)解，并為其臨床試驗(yàn)和應(yīng)用提供了合理、有效的參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突