堯 月，蘇炳銀，李淑蓉△，韓玉萍△

1.成都醫(yī)學院 發(fā)育與再生四川省重點實驗室(成都 610500)；2.成都醫(yī)學院 病理學與病理生理學教研室(成都 610500)；3.成都醫(yī)學院 組織胚胎學教研室(成都 610500)

血腦屏障(blood brain barrier,BBB)是一種多細胞血管結(jié)構，主要由腦微血管內(nèi)皮細胞、周細胞、星形膠質(zhì)細胞和基底膜組成，將中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)與外周血液循環(huán)分開。腦內(nèi)皮細胞具有連續(xù)的細胞間緊密連接，無內(nèi)皮窗孔且具有極低的胞吞率，極大限制了分子經(jīng)細胞旁和跨細胞轉(zhuǎn)運通過內(nèi)皮細胞，導致大分子或親水分子需要通過能量依賴性機制(如載體介導的轉(zhuǎn)運)進行跨細胞轉(zhuǎn)運[1-3]。半導體聚合物量子點(semiconducting polymer dots，Pdots)具有高熒光亮度、快速穩(wěn)定的發(fā)射速率、優(yōu)異的光穩(wěn)定性及無毒特性，在生物成像上極具優(yōu)勢；Pdots與生物大分子共價連接，生物分子作為配體與細胞表面特異性受體相互作用，能夠?qū)⒃搹秃衔镞f送至細胞[4]?？袢〔《咎堑鞍?9(rabies virus glycoprotein 29，RVG29)，含有29個氨基酸，可通過煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAchR)和γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)受體介導的轉(zhuǎn)運作用有效跨越BBB，其受體廣泛分布于腦微血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元的細胞膜，為納米復合物通過BBB并進入神經(jīng)元提供了可能性[5-6]。目前國內(nèi)外已有使用RVG29修飾納米材料穿透BBB的研究[7-8]，但使用Pdots作為納米載體僅有體外穿透BBB模型的報道[9]，尚無體內(nèi)研究。本實驗首先合成并表征Pdots與Pdots-RVG，體外檢測神經(jīng)細胞攝取納米材料；隨后腹腔注射Pdots與Pdots-RVG納米復合物，通過流式細胞術檢測各組織器官的Pdots陽性細胞率，以探究納米顆粒的生物富集。本實驗首次使用流式細胞術在細胞層面分析納米材料的生物富集，該方法收樣及檢測快速、操作較簡單、生物學重復結(jié)果較穩(wěn)定，可作為納米材料生物富集的初步探索。

1 材料與方法

1.1 試劑

小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元細胞系(mouse midbrain dopaminergic cells，MN9D)由中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫提供，DMEM/F12培養(yǎng)基、雙抗(青霉素+鏈霉素)(penicillin-streptomycin，PS)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、0.25%胰酶均購自美國Gibico公司，超濾離心管(2 mL/100 kDa)購自美國Millipore公司，9，9-二辛基聚芴苯并噻二唑交替共聚物[poly(9,9-dioctylfluorene-alt-benzothiadiazole)，F(xiàn)8BT]、四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)、聚苯乙烯-馬來酸酐(polystyrene-co-maleic anhydride，PSMA)、多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)均購自德國Sigma-aldrich公司，RVG29-Cys購自上海吉爾生化公司，4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES]、臺盼藍與4′,6-二脒基-2-苯基吲哚[2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride,DAPI]購自上海碧云天公司，細胞增殖-毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購自日本同仁公司，水合氯醛購自上海生工生物公司，細胞濾網(wǎng)購自北京Biosharp公司。

1.2 實驗儀器

低速離心機(Sorvall ST16)(美國，Thermo Fisher)，倒置顯微鏡(BX-63)(日本，Nikon)，生物安全柜(1300 SERIES A2)(美國，Thermo Fisher)，細胞培養(yǎng)箱(Forma 3111)(美國，Thermo Fisher)，粒度電位儀(Zetasizer Nano ZS90)(英國，Malvern)，激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000)(日本，Olympus)，流式細胞儀(Accuri C6)(美國，BD)。

1.3 納米顆粒制備與評價

1.3.1 Pdots制備 采用納米共沉淀的方法制備Pdots。將36 mg F8BT、8.976 mg PSMA溶解于144 mL THF，迅速將混合液加入至正超聲的雙蒸水中，超聲15 min至溶液澄清透明，將溶液置于通風櫥通風過夜以蒸發(fā)多余THF。將得到的溶液用100 kDa超濾管離心提純，將提純后的溶液通過0.22 μm濾膜以得到濃度為1 g/L的Pdots原液，密封，4 ℃冰箱避光保存。

1.3.2 Pdots-RVG制備 按順序依次加入Pdots(1 g/L)、HEPES(1 mmol/L)、RVG(1 mmol/L)，充分混合20 min。其中Pdots與RVG按照3∶1(w/v)混合，HEPES終濃度為1 μmol/L。Pdots-RVG混合液現(xiàn)用現(xiàn)配，盡量避光操作。

1.3.3 動態(tài)光散射技術 采用動態(tài)光散射技術(dynamic light scattering，DLS)檢測納米顆粒粒徑及Zeta電位。將樣品稀釋至合適倍數(shù)，使用粒度電位儀測量，獲得其平均粒徑(Z-average)、多分散系數(shù)(particale dispersion index，PDI)及Zeta電位。

1.4 納米顆粒生物相容性及細胞攝取

1.4.1 細胞培養(yǎng) 取MN9D液氮凍存細胞于37 ℃水浴鍋中迅速解凍，稀釋離心并重懸后，加入含10%FBS、1%PS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換新鮮完全培養(yǎng)基。待細胞長至80%～90%時，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代或鋪板。

1.4.2 CCK-8檢測細胞存活率 對數(shù)生長期細胞按照每孔5×104個/mL的密度接種至96孔板中，每孔100 μL。第2天待細胞完全貼壁后更換為含2% FBS細胞培養(yǎng)基，加入藥物處理48 h，更換新鮮培養(yǎng)基并加入10% CCK-8，避光培養(yǎng)2～4 h直至培養(yǎng)液變?yōu)槌壬?，酶標儀檢測450 nm處吸光度。細胞分組及處理：設置對照組、Pdots組、Pdots-RVG組，每組設置5個復孔；其中，對照組為空白對照組(只含CCK-8試劑，不含細胞)及陰性對照組(只含納米材料及CCK-8，不含細胞)。Pdots濃度在實驗組中均設置為5、25、50、200 mg/L。細胞存活率(%)=[A(實驗組)-A(空白組)-A(陰性組)]/[A(對照組)-A(空白組)-A(陰性組)]×100%。

1.4.3 納米材料的細胞攝取 24孔板中放置細胞爬片并潤洗，取對數(shù)生長期MN9D細胞按照每孔5×105個/mL密度,接種至24孔板中。待細胞貼壁后,使用Pdots與Pdots-RVG(Pdots濃度為5 mg/L)分別與細胞共孵育1、2、4、8、12、24 h，經(jīng)4% PFA固定后DAPI染色，于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細胞綠色熒光攝取，激發(fā)波長為364 nm(DAPI)及488 nm(Pdots)。

1.5 納米材料體內(nèi)蓄積

1.5.1 實驗動物 雄性C57BL/6小鼠12只，體重20～25 g，購自成都達碩動物科技有限公司，飼養(yǎng)環(huán)境相對濕度40%～70%，溫度約為25%，每日光照12 h，自由攝食飲水。實驗用鼠均嚴格按照國際衛(wèi)生研究機構的倫理指南處理，項目過程均在成都醫(yī)學院實驗動物福利倫理委員會監(jiān)督下進行。

1.5.2 小鼠給藥 小鼠隨機分為PBS組、Pdots組、Pdots-RVG組3組，每組4只，均采用腹腔注射，Pdots注射劑量為1 mg/g，40 h后收樣。

1.5.3 機械-酶消化法制備組織單細胞懸液 小鼠臟器單細胞懸液制備4%水合氯醛腹腔麻醉，75%乙醇浸泡后置于超凈工作臺，并固定四肢。膈下作橫行切口暴露肝臟及隔膜，剪破隔膜并剪開胸腔皮膚和肋骨，暴露心臟及肺，使用磨平的注射器針頭插入小鼠左心室；同時剪破右心耳使血液流出，灌注生理鹽水，直至小鼠肝臟變白。取小鼠心、肝、脾、肺、腎各10 mg，取腦(嗅球、皮層、紋狀體、海馬、中腦黑質(zhì))，置于4 ℃ PBS中漂洗；置于1.5 mL EP管中，加入胰酶，眼科剪剪碎組織至糊狀，于37 ℃水浴消化30 min，每5 min吹打混勻1次；FBS終止消化，過700 μm細胞篩網(wǎng)得單細胞懸液。PBS洗3次，4%PFA固定10 min，流式細胞術檢測，激發(fā)波長為488 nm。

1.5.4 臺盼藍活細胞檢測 分別取各組組織單細胞懸液以1∶1加入臺盼藍溶液，染色3 min，取20 μL制作細胞涂片，顯微鏡下觀察并計算細胞存活率。細胞存活率=活細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 Pdots與Pdots-RVG的表征

PDI表示粒徑分布的離散程度，PDI越小，說明粒子粒徑分布越集中，PDI最佳范圍為0.08～0.70。經(jīng)粒度儀檢測，Pdots平均粒徑為105.10 nm，PDI為0.125，分散性好，Zeta電位為-33.83 mV；Pdots與RVG復合后，主要有兩種粒徑，但僅極少量Pdots-RVG粒徑較大，平均粒徑為339.13 nm，PDI為0.461，分散性良好，Zeta電位為-18.20 mV(圖1、表1)。

圖1 Pdots與Pdots-RVG粒徑、Zeta電位分布圖

表1 Pdots、PR平均粒徑與Zeta電位

2.2 納米材料的生物相容性

為研究Pdots-RVG作為藥物載體的細胞毒性，使用梯度濃度的Pdots與Pdots-RVG與MN9D細胞共孵育48 h后，CCK-8試劑盒檢測MN9D細胞的細胞存活率。實驗結(jié)果顯示，隨著Pdots與Pdots-RVG濃度增加，細胞存活率均逐漸下降。在Pdots濃度為5 mg/L時，Pdots與Pdots-RVG組細胞存活率高于90.0%；當Pdots濃度為100 mg/L時，兩組細胞存活率仍高于70%；且相同Pdots濃度下，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Pdots與Pdots-RVG均表現(xiàn)出較低的細胞毒性(表2)。

表2 不同濃度Pdots、PR處理后細胞存活率比較

2.3 MN9D細胞攝取納米材料

制備的Pdots在熒光顯微鏡下呈點狀散在綠色熒光顆粒。使用Pdots終濃度為5 mg/L的Pdots、Pdots-RVG與MN9D細胞共孵育1～12 h后，于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察MN9D細胞對納米材料的攝取。結(jié)果顯示，Pdots在1 h時極少被攝取，隨著共孵育時間延長，細胞攝取的Pdots材料逐漸增多，并較均勻散在分布于胞漿中。當Pdots連接了RVG后，1 h時已有部分材料被細胞攝取，隨著時間延長，胞漿中納米材料數(shù)量逐漸增多，熒光強度逐漸增強，并逐漸向核周聚集，但未穿透核膜進入核內(nèi)。Pdots-RVG組與Pdots組相比，相同時間內(nèi)Pdots-RVG組細胞攝取的Pdots更多(P<0.05)，且在1 h時Pdots-RVG的細胞攝取量就已超過12 h時Pdots的攝取量(圖2)。

圖2 MN9D細胞攝取納米顆粒

2.4 Pdots-RVG穿過小鼠BBB并在腦及主要臟器中的分布

將組織制作為單細胞懸液，流式細胞術檢測其Pdots陽性細胞數(shù)量，分析經(jīng)腹腔注射后納米材料的生物分布。經(jīng)機械-酶消化的細胞呈分散狀，少許粘連，雜質(zhì)及細胞碎片較少，死亡細胞被臺盼藍染成藍色(圖3)，共統(tǒng)計10個視野,計算細胞存活率為92.4%。經(jīng)流式細胞術檢測，Pdots在大腦中無分布，主要在心、肝、脾、肺中蓄積，在腎臟中有少量蓄積；Pdots-RVG則主要在腦(嗅球、皮層、紋狀體、海馬、中腦黑質(zhì))和心臟中蓄積，其余周圍臟器中無蓄積(表3)。

圖3 臺盼藍染色觀察大腦皮層細胞完整性

表3 流式細胞術檢測各組織中Pdots陽性細胞百分比

3 討論

2020年世界衛(wèi)生組織報道，包括阿爾茨海默病和帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病、腦卒中的死亡人數(shù)日益上升，而大多數(shù)小分子藥物和所有大分子藥物(如重組蛋白、治療性抗體和核酸)因分子大小、親水性、解離度等特性均不能穿過BBB[10]。因此，開發(fā)能夠有效將治療劑轉(zhuǎn)運到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物遞送系統(tǒng),對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療至關重要。

納米顆粒在醫(yī)學上廣泛用于生物成像、藥物輸送、疾病的診斷和治療[11-13]，其中Pdots是近年研究熱點。與傳統(tǒng)有機小分子、半導體量子點和無機納米材料相比，Pdots具有以下特點：1)高穩(wěn)定性；2)明亮的熒光信號；3)低細胞毒性；4)可修飾及功能化的表面；5)可封裝難溶于水的活性物質(zhì)[14]，能夠作為熒光探針用于細胞標記及體內(nèi)成像，同時封裝藥物進行遞送。基于納米技術，許多方法被廣泛用于跨BBB轉(zhuǎn)運治療藥物，例如受體介導的內(nèi)吞作用、機械或超聲破壞BBB、細胞穿透肽介導穿過BBB和納米材料的鼻內(nèi)遞送等[15]。其中，受體介導的轉(zhuǎn)運(receptor-mediated transport，RMT)是利用腦微血管內(nèi)皮細胞的囊泡運輸機制，通過BBB管腔側(cè)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、胰島素和胰島素樣生長因子受體、低密度脂蛋白受體和nAChR等受體將相應蛋白質(zhì)輸送至大腦[16-17]。本研究采用特定配體RVG29對Pdots表面進行功能化，RVG29通過與腦微血管內(nèi)皮細胞及神經(jīng)元細胞上的nAChR特異性結(jié)合，使納米復合物穿過BBB后進入神經(jīng)元細胞內(nèi)[6]，以達到特異性遞送至腦部的效果。

本研究結(jié)果表明，Pdots平均粒徑為105.10 nm，Pdots-RVG平均粒徑為339.13 nm，分散性均良好；Pdots Zeta電位為-33.83 mV，Pdots-RVG Zeta電位上升至-18.20 mV，表明Pdots與RVG成功復合。低濃度Pdots與Pdots-RVG的細胞毒性均較低，且兩組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Pdots-RVG與Pdots相比，能被神經(jīng)細胞更多、更快地攝取。采用流式細胞術分析納米顆粒的體內(nèi)蓄積，尤其對腦部不同解剖學位置加以檢測，以初步探究Pdots連接RVG后體內(nèi)遞送的改變。采用機械法與酶消化聯(lián)合制備組織單細胞懸液[18-21]，經(jīng)臺盼藍染色后鏡下觀察細胞顯示，單細胞懸液細胞存活率為92.4%，但細胞不夠分散，可能是由于僅用胰酶消化，未采用胰酶-膠原蛋白酶聯(lián)合消化所致。經(jīng)流式細胞術檢測，Pdots幾乎不能通過BBB，并主要在心臟、肝臟和肺中蓄積；在制樣中發(fā)現(xiàn),脾臟的單細胞懸液呈淡紅色，Pdots在脾臟中的高蓄積可能是由于未完全去除的紅細胞所致。Pdots-RVG能夠穿透BBB并在嗅球、皮層、紋狀體、海馬、黑質(zhì)中蓄積，且在周圍臟器的富集程度下降，表明Pdots連接了腦靶向生物分子RVG29后，能夠穿過BBB并進入神經(jīng)細胞內(nèi)，但其遞送速率及效率還有待研究。

綜上所述，使用腦靶向分子RVG29與載體Pdots復合，建立Pdots-RVG納米遞送系統(tǒng)，能通過小鼠BBB并在腦內(nèi)有明顯蓄積。Pdots-RVG作為載體后續(xù)可搭載神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗氧化劑及基因靶向藥物等神經(jīng)治療性藥物，為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的思路。