陳碧樂(lè)，洪俊英，劉夢(mèng)召，謝作聽(tīng)

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，浙江 溫州 325015

類(lèi)孟買(mǎi)血型是H血型系統(tǒng)的一種稀有表型[1]，其主要特征為紅細(xì)胞上H抗原部分或完全缺失/轉(zhuǎn)化，紅細(xì)胞表面缺乏ABH抗原，而在唾液等分泌液中卻可以找到ABH血型物質(zhì)[2]，血漿中常存在抗H抗體。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于類(lèi)孟買(mǎi)血型的報(bào)道逐漸增多，其中以A、B類(lèi)孟買(mǎi)血型居多，而AB類(lèi)孟買(mǎi)血型較少見(jiàn)[3-6]。本研究對(duì)一例由FUT1 等位基因堿基缺失導(dǎo)致H抗原不表達(dá)形成AB類(lèi)孟買(mǎi)血型的家系進(jìn)行血型血清學(xué)鑒定和基因突變分析，初步探討其分子生物學(xué)機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 先證者，女，35歲，漢族，體健，既往無(wú)輸血史，因健康體檢于2021年10月來(lái)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心就診并申請(qǐng)血型鑒定，血型血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果疑似其血型為類(lèi)孟買(mǎi)型。參與本次調(diào)查的家系成員包括其母親、哥哥、姐姐及兩個(gè)女兒的血液進(jìn)一步進(jìn)行血型及基因檢驗(yàn)。標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)研究前嚴(yán)格履行知情同意及倫理論證流程。

1.2 試劑及儀器 IH-1000全自動(dòng)血型鑒定儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；專(zhuān)用離心機(jī)（臺(tái)灣貝索企業(yè)有限公司，型號(hào)2005-2）；OLYMPUSCX21普通光學(xué)顯微鏡（日本歐林巴斯公司）；微柱凝膠卡（瑞士DiaMed公司，批號(hào)5007267709）；單克隆抗A、抗B試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)20190915）；人ABO反定型紅細(xì)胞（北京金豪制藥股份有限公司，批號(hào)20201001024）；抗-H、抗-Lea、抗-Leb試劑（德國(guó)GmbH公司，批號(hào)分別為OHM142-2、OLeaM121-1、OLebM109-1）；不規(guī)則抗體篩選試劑（江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)202010020）；不規(guī)則抗體特異性鑒定譜細(xì)胞（匈牙利REAGENSKft公司，批號(hào)732021）；3%O型臍帶血洗滌紅細(xì)胞（本室自制）。

1.3 血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.3.1 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)：ABO血型正反定型，采用鹽水介質(zhì)試管法和微柱凝膠抗人球蛋白法；紅細(xì)胞上弱A、B、H抗原檢測(cè)，采用4℃-吸收-56℃-放散法；唾液中可溶性A、B、H血型物質(zhì)檢測(cè)，采用中和抑制試驗(yàn)；Lea、Leb抗原檢測(cè)，采用鹽水介質(zhì)試管法[7]。

1.3.2 紅細(xì)胞血型不規(guī)則抗體篩查與鑒定：采用鹽水介質(zhì)試管法和微柱凝膠抗人球蛋白法，確定抗體免疫球蛋白類(lèi)型和抗體特異性。若抗體特異性疑為IgM類(lèi)抗H或抗HI抗體時(shí)，加做O型臍帶血洗滌紅細(xì)胞反應(yīng)；若O型臍帶血洗滌紅細(xì)胞不凝集時(shí)判為抗HI抗體，否則判為抗H[8]。

1.3.3 DNA抽提和PCR擴(kuò)增：用美國(guó)Invitrogen公司血液基因組DNA提取試劑盒，提取先證者及其家系成員外周血標(biāo)本基因組DNA。采用PCR分別擴(kuò)增ABO基因、FUTl基因和FUT2基因，引物序列見(jiàn)表1，擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)報(bào)道[6]。

1.3.4 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序：采用DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）純化ABO 基因、FUTl基因和FUT2 基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，將純化PCR產(chǎn)物用作測(cè)序反應(yīng)DNA模板，在ABI-3100Avant測(cè)序儀檢測(cè)分析。用Chromas2.33軟件閱讀圖譜，GeneRunnerversion3.05 軟件拼合、比對(duì)和分析測(cè)序結(jié)果，將測(cè)序結(jié)果與人類(lèi)紅細(xì)胞血型基因數(shù)據(jù)庫(kù)基因序列進(jìn)行比對(duì)。

表1 ABO、FUT1、FUT2 引物序列及參考基因序列號(hào)

2 結(jié)果

2.1 血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 ABO血型正反定型：先證者微柱凝膠法正反定型結(jié)果不符，鹽水介質(zhì)試管法正反定型結(jié)果存疑（表現(xiàn)為反定型凝集強(qiáng)度異常）；其他家系成員兩種方法正反定型結(jié)果相符，見(jiàn)表2。

2.1.2 紅細(xì)胞上弱A、B、H抗原檢測(cè)：先證者紅細(xì)胞未檢測(cè)到H抗原，紅細(xì)胞放散液檢到A抗原（未檢到B抗原），見(jiàn)表2。

2.1.3 先證者紅細(xì)胞不規(guī)則抗體篩查和鑒定：經(jīng)鹽水介質(zhì)試管法和微柱凝膠抗人球蛋白法，證明存在IgM類(lèi)抗HI抗體，見(jiàn)表2。

2.1.4 紅細(xì)胞Lea、Leb抗原檢測(cè)：先證者及其家系成員Lewis血型均為L(zhǎng)ea（-）Leb（+），見(jiàn)表2。

2.2 唾液中可溶性血型物質(zhì)A、B、H檢測(cè)結(jié)果 先證者唾液中檢到A、B、H血型物質(zhì)，可判定先證者ABH血型物質(zhì)為分泌型。其家系成員唾液中檢到的ABH血型物質(zhì)與ABO正定型檢到的抗原一致，見(jiàn)表2。

2.3 ABO、FUT1 和FUT2 基因檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 ABO基因直接測(cè)序結(jié)果：先證者ABO基因型為：ABO*A1.02/B.01，其ABO糖基轉(zhuǎn)移酶基因第6及7外顯子序列為：c.467C＞T、c.297A＞G、c.526C＞G、c.657C＞T、c.703G＞A、c.796C＞A、c.803G＞C和c.930G＞A，證實(shí)先證者血型為AB型。

表2 先證者及其家系成員的血型血清學(xué)結(jié)果

2.3.2 FUT1 和FUT2 基因測(cè)序結(jié)果：直接測(cè)序顯示先證者FUT1 基因有2 處雜合缺失突變，分別位于編碼區(qū)序列第551～第552位堿基AG雜合缺失突變（c.551-552delAG）和第880～第882位堿基TT雜合缺失突變（c.881-882delTT），因此推測(cè)同源染色體上的兩個(gè)等位基因H都各自發(fā)生了缺失突變；其母親、姐姐、大女兒和小女兒FUT1 基因均為c.881-882delTT雜合缺失突變，哥哥為c.551-552delAG雜合缺失突變，均為H/h基因型，能表達(dá)H抗原。先證者FUT2 基因測(cè)序結(jié)果存在c.357C＞T純合多態(tài)性。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 先證者FUT1 基因測(cè)序結(jié)果（A、B）及FUT2 基因測(cè)序結(jié)果（C）

3 討論

人類(lèi)H血型物質(zhì)的表達(dá)與H基因（FUT1）和Se基因（FUT2）密切相關(guān)，且與ABO基因、Lewis基因（FUT3）存在一定關(guān)聯(lián)。ABO 基因位于9號(hào)染色體，F(xiàn)UT1、FUT2和FUT3均位于19號(hào)染色體。FUT1編碼II型α-1，2-L-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，可催化II型H前體物質(zhì)合成紅細(xì)胞上的H物質(zhì)；FUT2 編碼可催化分泌液中的I型H前體物質(zhì)合成可溶性H物質(zhì)，故FUT1 或（和）II型α-1，2-L-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶缺乏或突變時(shí)，會(huì)影響紅細(xì)胞H物質(zhì)的表達(dá)，而FUT2 或（和）I型α-1，2-L-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶缺乏或突變時(shí)，會(huì)影響分泌液中H物質(zhì)的表達(dá)。H抗原是A、B抗原形成的前體物質(zhì)，當(dāng)H抗原缺失或突變，可導(dǎo)致紅細(xì)胞上A、B抗原合成障礙，最終形成類(lèi)孟買(mǎi)血型[6]。

類(lèi)孟買(mǎi)血型是一種罕見(jiàn)的紅細(xì)胞表型，在中國(guó)人群中的比例總體較低，約為十幾萬(wàn)分之一[9]，但在中國(guó)臺(tái)灣比例為1/8000～1/10000，中國(guó)香港則為1/15620[10-11]。在我國(guó)大陸主要見(jiàn)于南方地區(qū)，其中福建地區(qū)頻率大約為1/8500，而云南少數(shù)民族拉祜族中的頻率比較高，達(dá)2.2%[12]。中國(guó)人群中常見(jiàn)的類(lèi)孟買(mǎi)血型多為分泌型，其FUT1基因型為h/h，其中常見(jiàn)的FUT1基因突變有h1（c.551-552delAG）、h2（c.881-882delTT）、h3（c.658C＞T）等。研究表明[13-14]，多數(shù)類(lèi)孟買(mǎi)血型為FUT1 基因純合突變引起，少數(shù)由復(fù)合雜合突變引起。本例先證者為類(lèi)孟買(mǎi)血型復(fù)合雜合突變，其FUT1 基因型為h1h2。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)血型血清學(xué)發(fā)現(xiàn)先證者正定型為弱A型，反定型為Ac2+、Bc1+，血型結(jié)果表現(xiàn)為正反定型不符。進(jìn)一步細(xì)胞吸收放散試驗(yàn)也只檢測(cè)到弱A抗原，分析原因可能因先證者為分泌型，使血漿中少量H抗原吸附到紅細(xì)胞上，并繼續(xù)連接α-半乳糖。ABO基因分析顯示，先證者ABO血型的基因型為ABO*A1.02/B.01。FUT1基因分析顯示，先證者存在雙雜合缺失突變，分別為c.551-552delAG雜合缺失突變和c.881-882delTT雜合缺失突變。有文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]，上述兩種突變均導(dǎo)致閱讀框架發(fā)生移碼，在氨基酸翻譯過(guò)程中提前出現(xiàn)終止密碼子，形成截短的α-1，2-L-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，使酶活性大大減低，從而不能有效合成H抗原（即基因型h/h）。FUT2 基因分析顯示，先證者存在c.357C＞T純合多態(tài)性，此位點(diǎn)屬無(wú)意義突變，因未改變編碼的天冬酰胺，從而不影響α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性[17]，故先證者仍表現(xiàn)為分泌型。

該家系調(diào)查顯示，先證者的母親、姐姐、哥哥和兩個(gè)女兒均為單鏈FUT1 基因突變攜帶者，符合類(lèi)孟買(mǎi)血型隱性遺傳方式，只要存在一個(gè)有功能的FUT1 等位基因（基因型H/H或H/h），紅細(xì)胞即可表達(dá)H抗原[18]。因此，該家系其他成員的ABO血型表型均正常。先證者的母親和姐姐FUT1 基因均為c.880-882delTT雜合缺失突變，表明先證者和其姐姐FUT1 基因突變來(lái)自其母親；其哥哥FUT1 基因?yàn)閏.551-552delAG雜合缺失突變，故推測(cè)可能來(lái)自其父親。由于條件受限，本研究未能獲取先證者父親血液，故無(wú)法對(duì)其基因突變位點(diǎn)進(jìn)行直接驗(yàn)證。

類(lèi)孟買(mǎi)血型紅細(xì)胞上只有微量A和（或）B抗原，在常規(guī)血型血清學(xué)檢測(cè)中很難檢測(cè)到，因此常被誤定為其他血型。本研究通過(guò)血型血清學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，家系調(diào)查，探討了AB類(lèi)孟買(mǎi)血型的分子生物學(xué)機(jī)制，為類(lèi)孟買(mǎi)血型的正確鑒定和安全輸血提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。