李宏良，田華琴*，王斌，李巖，王凱，梁貴文，陳學(xué)彰，朱志霞，陳錫康

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬佛山中醫(yī)院腫瘤中心，廣東 佛山 528000；2.中國科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101；3.廣東中科康儀生物技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528300)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，癌基因起了重要作用。近年來國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)[1]，微小RNA(microRNA，miRNA)參與了這些癌基因的表達(dá)調(diào)控。亦有研究報(bào)道[2]，中藥及其活性成分對miRNA具有廣泛調(diào)節(jié)作用，通過上調(diào)或下調(diào)miRNA進(jìn)一步促進(jìn)其靶基因降解或抑制其靶基因的翻譯可能發(fā)揮抗腫瘤作用。乳積方是本研究組用以防治乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的經(jīng)驗(yàn)方。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[3]，乳積方制劑對乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞株的生長具有抑制作用，其中對MDA-MB-231效果更為明顯。本研究擬探討乳積方對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響，利用差異化miRNA靶基因預(yù)測及GO&Pathway分析獲取其相關(guān)的生物學(xué)功能，通過QPCR驗(yàn)證差異化表達(dá)miRNA，以明確乳積方抗腫瘤的作用靶點(diǎn)，進(jìn)而為指導(dǎo)乳腺癌中醫(yī)治療方案的優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

乳積方由柴胡、白芍、黨參、八月札、瓜蔞皮、浙貝母、穿山甲、海藻等組成，購自廣州至信藥業(yè)有限公司。

1.2 細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231由中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院提供。

1.3 主要儀器和試劑

MultiskanFC酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；BDS400倒置熒光顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)；NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(美國NanoDrop科技有限責(zé)任公司)；MAUI生物芯片雜交儀(美國BioMicro Systems)；GenePix4000B芯片掃描儀(美國Axon公司)；Gene Amp PCR System 9700(美國Thermo公司)；ViiATM7 Real-Time PCR System(美國Thermo公司)；miRCURYTM LNA Array (v.19.0)芯片(丹麥Exiqon公司)；RNasey Mini Kit 試劑盒(德國QIAGEN公司)；2X PCR master mix試劑盒(美國Arraystar)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；miRCURYTM Array Power Labeling kit (Cat # 208032-A)試劑盒(丹麥Exiqon公司)；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Hyclone公司)。

2 方法

2.1 藥物制備

乳積方由柴胡10 g，白芍15 g，黨參15 g，八月札15 g，瓜蔞皮15 g，浙貝母10 g，穿山甲10 g，海藻15 g等組成，藥材經(jīng)品種鑒定后用文火煎煮2次，合并藥液，過濾，棄去藥渣，將濾液煎煮濃縮至每1mL含生藥2 g。取適量藥液用無菌水將乳積方配制成2 mg/mL的濃度，以0.22 μm微孔濾膜過濾器過濾除菌，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231在37 ℃、5% CO2條件下，用含有鏈霉素(50 units/mL)，青霉素(100 units/mL)、胎牛血清(10%)等試劑的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)達(dá)到培養(yǎng)瓶80%空間密度按照常規(guī)的細(xì)胞傳代方法傳代。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理

以密度1×106個(gè)/孔接種人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231于6孔板中，分為對照組和處理組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對照組3孔標(biāo)記為對照1(CK1)、對照2(CK2)、對照3(CK3)；處理組3孔標(biāo)記為Treatment1、Treatment2、Treatment3。對照組用上述DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，處理組用含乳積方藥物的上述DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，藥物濃度為0.04 g/mL(IC50)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h。

2.4 RNA提取及質(zhì)檢

收集對照組和處理組MDA-MB-231細(xì)胞，使用Trizol提取總RNA，并用RNasey Mini Kit進(jìn)行純化，使用NanoDrop測定純化后的RNA濃度。使用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測純化后的RNA純度和完整性。

2.5 miRNA芯片試驗(yàn)

使用miRCURYLNATM Array Power Labeling kit對miRNA進(jìn)行標(biāo)記，即用Hy3TM熒光基團(tuán)標(biāo)記miRNA。標(biāo)記完成后，將標(biāo)記好的樣品與雜交緩沖液混合，95 ℃變性2 min，置于冰上2 min；再將上述混合物與芯片56 ℃下雜交16 h，雜交完成后，用清洗液清洗芯片。將芯片放入掃描儀中進(jìn)行掃描，使用GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號值。

2.6 芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理及差異基因的篩選

通過芯片中位值對miRNA芯片原始信號值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。通過標(biāo)準(zhǔn)化的信號值計(jì)算出每個(gè)miRNA在不同樣品間(即對照組和處理組)的表達(dá)變化(差異倍數(shù)foldchange)，并通過t-test計(jì)算樣品間miRNA表達(dá)量變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。表達(dá)變化倍數(shù)在2倍以上，為差異化表達(dá)miRNA；表達(dá)倍數(shù)在2倍以上且P值<0.05的miRNA，為顯著性差異表達(dá)的miRNA。此外，對不同樣品組之間差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行圖形化展示，即火山圖分析。

2.7 miRNA靶基因預(yù)測及相關(guān)分析

通過匯總兩大數(shù)據(jù)庫(mirdbV5和TaregetScan7.1)的已知miRNA靶點(diǎn)信息，將兩大數(shù)據(jù)庫的結(jié)果交集作為最終miRNA的靶基因結(jié)果，以降低靶基因預(yù)測的假陽性率。此外，通過GO分析和pathway分析預(yù)測miRNA及其靶基因可能具有的生物學(xué)功能。

2.8 RT-PCR驗(yàn)證

首先將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后將所有cDNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以U6為內(nèi)參對照，具體實(shí)驗(yàn)步驟及引物序列如下，最后采用2-△△CT分析方法計(jì)算目的基因的表達(dá)差異。

2.8.1 將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA

①RNA模板加Poly A尾 Poly A尾的反應(yīng)體系由300 ng總RNA模板，1 μL ATP(10 mmol)，1 μL 10×A-Plus 反應(yīng)緩沖液，0.5 μL A-Plus Poly(A) 聚合酶 (4 U/uL)，0.2 μL RNA酶抑制劑(40 U/μL)，加水至10 μL。反應(yīng)條件：37 ℃孵育10 min后立即于-20 ℃保存20 min備用。

②制備RT引物混合液 將1 μL的oligo dT接頭引物(0.5 μg/μL)和0.3 μL的U6(下游引物)(0.1 μmol/L)混勻，然后將RT引物混合液加入上述加Poly A尾反應(yīng)體系中，輕輕吹打混勻后，5 000 r/min短暫離心，于60℃孵育5 min后冷卻至室溫放置3 min備用。

③制備RT混合反應(yīng)液 將4 μL的dNTP(每一種均為2.5 mmol)，2 μL的10×RT緩沖液，0.4 μL的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(10U/μL)和0.3 μL的RNA酶抑制劑(40U/μL)混勻，然后將RT混合反應(yīng)液加入上述反應(yīng)體系，總體積為20 μL，在PCR儀進(jìn)行RT反應(yīng)。反應(yīng)條件37 ℃孵育60 min后，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.8.2 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系由5 μL的2×Master Mix，0.5 μL的10 μmol/L的PCR特異引物F，0.5 μL的10 μmol/L的PCR特異引物R，2 μL的cDNA加水至10 μL組成。

反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；變性95 ℃ 10 s，退火、延伸60 ℃ 60 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，條件為95 ℃10 s，60℃ 60 s，95 ℃ 15 s；從60℃～99℃繪制熔解曲線。

2.8.3 引物序列信息

內(nèi)參及目的基因的引物序列見表1、表2。

表1 cDNA合成涉及引物序列

表2 實(shí)時(shí)定量PCR涉及引物序列

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 17. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。兩組間比較采用配對t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 miRNA差異化分析

前期MTT結(jié)果顯示，乳積方制劑對乳腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞均有抑制其生長的效果，其中對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231效果更為明顯；本次選擇IC50值乳積方處理MDA-MB-231細(xì)胞，miRNA芯片表達(dá)圖譜研究發(fā)現(xiàn)：乳積方誘導(dǎo)了hsa-miR-661、hsv1- miR-H17、hsa- miR-708-3p、hsa-miR-1287-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-4716-3p、hsa-miR-4315、hsa-miR-4658、hsa-miR-601等近百個(gè)差異上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)大于2的miRNA；通過增加其挑選條件,最終25個(gè)顯著差異化miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測GO及Pathway結(jié)果顯示,近1 000個(gè)基因與此25個(gè)miRNA相關(guān)，信號通路多涉及proteoglycans in cancer、pathways in cancer、pi3k-akt signaling pathway等；基因分布最廣的pathways in cancer相關(guān)的信號通路近172個(gè)基因。挑選其中21個(gè)顯著差異化的miRNA進(jìn)行QPCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,除hsa-miR-601外其他20個(gè)顯著差異化的miRNA變化趨勢同基因芯片趨勢相符合，更加證明了結(jié)果的可靠性。

采用基因芯片法研究藥物作用下miRNA的差異化表達(dá)情況。

3.1.1 樣本質(zhì)量檢測結(jié)果

NanoDrop ND-1000檢測 OD260/280≈2.0，OD260/230>1.8，表明提取的RNA純度高，雜質(zhì)少；變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測RNA的完整性，其中完整的RNA應(yīng)出現(xiàn)3條帶，其中28 s帶的亮度應(yīng)是18 s的兩倍，結(jié)果說明制備的RNA樣本是高純度的、完整性強(qiáng)的合格樣品，見圖1。

3.1.2 差異基因聚類分析

采用Agilent人類全基因表達(dá)芯片檢測兩組樣的差異表達(dá)基因，篩選兩組間差異倍數(shù)(經(jīng)log2轉(zhuǎn)換)2倍以上的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因，共篩選出219個(gè)差異表達(dá)基因，其中109個(gè)表達(dá)上調(diào)，110個(gè)表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步增大篩選標(biāo)準(zhǔn)至2倍表達(dá)差異且ForeGround強(qiáng)，篩選出25個(gè)差異化基因，對這25個(gè)基因進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示，兩組樣本間基因表達(dá)差異大。

更進(jìn)一步增大篩選標(biāo)準(zhǔn)至2倍表達(dá)差異且ForeGround強(qiáng)且P值≤0.05，篩選出10個(gè)顯著差異化表達(dá)的基因，其中5個(gè)上調(diào)，5個(gè)下調(diào)，差異基因火山圖見圖3，具體數(shù)值見表3。

表3 兩組差異基因的差異倍數(shù)、P值與FDR值

3.2 差異化miRNA的靶基因預(yù)測及GO Pathway分析

將篩選出來的差異化25個(gè)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測分析，選擇同時(shí)出現(xiàn)在targetscan7.1數(shù)據(jù)庫及mirdbv5數(shù)據(jù)庫的基因?yàn)槟繕?biāo)靶基因，有效降低了靶基因假陽性率。結(jié)果顯示，共有1 044個(gè)基因，差異基因韋恩圖見圖4。

注：1.對照1(CK1)中的總RNA；2.對照2(CK2)中的總RNA；3.對照3(CK3)中的總RNA；4.處理組1(Treatment1)中的總RNA；5.處理組2(Treatment2)中的總RNA；6.處理組3(Treatment3)中的總RNA。圖1 變性瓊脂糖凝膠電泳圖

注：紅色到綠色代表差異化基因在樣本中的表達(dá)量從高到低。圖2 兩組樣本差異化基因聚類分析圖

注:橫軸代表處理組和對照組之間miRNA表達(dá)倍數(shù)的變化(log2轉(zhuǎn)化)，縱軸代表相應(yīng)的P值(-log10轉(zhuǎn)化)?？v向綠線分別對應(yīng)2倍上調(diào)和下調(diào)，綠色平行線對應(yīng)0.05的P值。紅色區(qū)域?yàn)榫哂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異的miRNA。圖3 差異基因火山圖

注：紫色表示targetscan7.1數(shù)據(jù)庫預(yù)測的靶基因數(shù)目，橘色代表mirdbv5數(shù)據(jù)庫預(yù)測的靶基因數(shù)目。圖4 差異化miRNA的靶基因venn圖

將篩選出來的25個(gè)差異基因進(jìn)行GO功能分析，涉及生物過程1 000(Biological Process)個(gè)、細(xì)胞組分(cell component)180個(gè)、分子功能(molecular fuction)150個(gè)。GO富集分析中，P值<0.05的GO為顯著性GO。

Pathway分析結(jié)果顯示差異化基因主要涉及癌癥中蛋白聚糖、癌癥的信號通路、PI3K-Akt signaling pathway (human)、Ras signaling pathway、FoxO signaling pathway (human)、Endocytosis (human)等。部分結(jié)果如圖5所示。

圖5 部分Pathway的功能分析結(jié)果

3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證miRNA芯片結(jié)果

從篩選出來的(25個(gè))差異化表達(dá)基因中選擇差異化倍數(shù)及ForeGround較高的21個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。芯片結(jié)果顯示，hsa-miR-661、hsv1-miR-H17、hsa-miR-708-3p、hsa-miR-1287-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-1260a、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-3142、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-3149、hsa-miR-605-5p、hsa-miR-4528基因表達(dá)上調(diào)；hsa-miR-4716-3p、hsa-miR-4315、kshv-miR-K12-5-3p、hsa-miR4658、hsa-miR-601、ebv-miR-BART2-3p、hsa-miR-4501基因表達(dá)為下調(diào)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，hsa-miR-661、hsv1-miR-H17、hsa-miR-708-3p、hsa-miR-1287-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-1260a、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-3142、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-3149、hsa-miR-605-5p、hsa-miR-4528基因在實(shí)驗(yàn)組的相對表達(dá)量高于對照組，hsa-miR-4716-3p、hsa-miR-4315、kshv-miR-K12-5-3p、hsa-miR4658、ebv-miR-BART2-3p、hsa-miR-4501在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量低于對照組，除卻hsa-miR-601基因外，其他結(jié)果均同基因芯片相吻合，見圖6、圖7。

圖6 基因芯片中基因表達(dá)上調(diào)的基因QPCR驗(yàn)證結(jié)果

圖7 基因芯片中基因表達(dá)下調(diào)的基因QPCR驗(yàn)證結(jié)果

4 討論

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，主要通過與靶 mRNA3’非翻譯區(qū)完全或部分互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶 mRNA 降解或轉(zhuǎn)錄后的翻譯抑制，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5-10]，腫瘤細(xì)胞與正常組織來源的細(xì)胞間miRNA的表達(dá)譜具有明顯差異，推測miRNA在腫瘤形成過程中可能扮演著重要的角色。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌抑癌miRNA，如miR-200家族、miR-7、miR-30a、miR-125(125a和125b)、let-7、miR-206、miR-31、miR-342、miR-335和miR-126等表達(dá)下調(diào)，而致癌miRNA，如miR103/107、miR-10b、miR-221/222和 miR-21等表達(dá)上調(diào)，提示miRNA的失調(diào)在乳腺癌中起著重要的作用[11]。WANG等[12]對乳腺癌 MCF-7腫瘤細(xì)胞及正常組織miR-205的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)其在乳腺細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，miR-205的高表達(dá)可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制腫瘤的作用。SHAO等[13]研究認(rèn)為,高水平的血漿miR-200a和miR-210與轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的化療耐藥性相關(guān)，可能是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者化療耐藥性預(yù)測的有效生物標(biāo)志物。

乳積方是作者根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)結(jié)合乳腺癌多肝氣郁滯、癌毒難除的病因病機(jī)而設(shè)，具有舒肝健脾，化痰散結(jié)，軟堅(jiān)消積之功效。本方由柴胡、白芍、黨參、八月札、瓜蔞皮、浙貝母、穿山甲、海藻等組成。方中柴胡苦辛微寒，歸肝膽經(jīng)，具有舒肝理氣、升舉陽氣功效，為君藥；杭白芍苦酸，歸肝脾經(jīng)，養(yǎng)血柔肝，柴芍相合，疏肝柔肝、養(yǎng)血理氣；黨參甘平，補(bǔ)肺脾氣，補(bǔ)血生津，扶助正氣，方中大劑量黨參意在輔助機(jī)體正氣，加強(qiáng)祛除癌毒。上二者為臣藥。八月札、瓜蔞皮，性味均為甘寒，分別具有舒肝理氣和寬胸利氣的作用，此二者進(jìn)一步加強(qiáng)柴胡理氣舒肝功效，又可活血止痛助杭芍柔肝緩急；浙貝母與穿山甲同有化痰散結(jié)作用，其中浙貝母苦寒，重在清熱化痰、軟堅(jiān)散結(jié)，海藻苦咸寒，軟堅(jiān)散結(jié)，消痰，利水，穿山甲咸微寒，重在活血散瘀、軟堅(jiān)化痰，此三者重在化痰軟堅(jiān)，祛除痰瘀熱毒。海藻苦、咸、寒，能夠軟堅(jiān)、消痰、利水、退腫，山慈菇甘微辛，清熱解毒，化痰散結(jié)，此二者皆有化痰散結(jié)作用，且皆可用于痰瘀日久化熱化毒，因此，同為佐助藥物?？v觀全方，扶正與驅(qū)邪相結(jié)合，化痰散結(jié)與清熱解毒相配，氣血痰瘀同治。

現(xiàn)代研究顯示[14-19]，柴胡皂苷D作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后，能通過抑制細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)凋亡抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，通過抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)轉(zhuǎn)化從而抑制乳腺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并呈時(shí)間及濃度依賴性；浙貝母有效成分貝母堿，具有抗腫瘤并能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥；穿山甲能夠治療乳腺疾病、瘰疬、腫瘤等疾??；黨參含多種糖類、酚類、甾醇、揮發(fā)油、黃芩素葡萄糖甙、皂甙及微量生物堿，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及抗癌等多種生理活性，對化療放療引起的白細(xì)胞下降有提升作用；山慈菇水煎劑可以抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，并可將細(xì)胞周期阻滯在G期，同時(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并有效抑制其遷移；海藻所含的海藻多糖直接作用于腫瘤細(xì)胞,能夠激活人體免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

本課題前期研究[20-23]提示乳積方對化療乳腺癌患者具有增效減毒及提高機(jī)體免疫功能的作用，治療后未出現(xiàn)明顯骨髓抑制、腫瘤相關(guān)抗原 CA153下降、反映細(xì)胞免疫功能的CD3+/HLA-DR+(活化 T 淋巴細(xì)胞) 等指標(biāo)呈明顯升高趨勢。長期服用乳積方可以明顯改善乳腺癌術(shù)后患者的無疾病生存時(shí)間及生活質(zhì)量。

MDA-MB-231細(xì)胞是一種激素受體陰性的乳腺癌細(xì)胞株，研究發(fā)現(xiàn)[3]，乳積方對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株的生長具有明顯的抑制作用。為闡明乳積方抑制乳腺癌的機(jī)制，本文運(yùn)用miRNA芯片檢測乳積方作用后乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜的改變特征。研究發(fā)現(xiàn)0.04 g/mL 乳積方藥物作用MDA-MB-231細(xì)胞72 h，miRNA的表達(dá)譜存在219個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中109個(gè)表達(dá)上調(diào)，110個(gè)表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步增加差異miRNA篩選條件(ForeGround強(qiáng))，miRNA的表達(dá)譜存在25個(gè)差異表達(dá)的miRNA，通過GO&Pathway分析這25個(gè)差異表達(dá)miRNA對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231生物學(xué)功能的影響，發(fā)現(xiàn)這25個(gè)miRNA 共靶向接近1000個(gè)基因，涉及生物過程1000個(gè)、細(xì)胞組分180個(gè)、分子功能150個(gè)。這些基因顯著富集于PI3K-Akt通路、癌癥通路、Ras通路、FoxO通路、Endocytosis通路等信號通路，涉及細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等生物過程。實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果表明21個(gè)miRNA中，除hsa-miR-601外，其余20個(gè)miRNA的RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與miRNA芯片檢測結(jié)果一致，具體為hsa-miR-661、hsv1-miR-H17、hsa-miR-708-3p、hsa-miR-1287-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-1260a、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-3142、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-3149、hsa-miR-605-5p、hsa-miR-4528基因表達(dá)上調(diào)，hsa-miR-4716-3p、hsa-miR-4315、kshv-miR-K12-5-3p、hsa-miR4658、ebv-miR-BART2-3p、hsa-miR-4501基因表達(dá)下調(diào)。

乳積方之中藥活性成分眾多，miRNA可能參與了中藥活性成分的抗腫瘤作用，從miRNA的角度探究乳積方對乳腺癌細(xì)胞的分子機(jī)制為中醫(yī)治療乳腺癌提供新的切入點(diǎn)。但是在眾多的活性成分中，調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)以致發(fā)揮抗腫瘤作用的完整通路及關(guān)鍵成分還未知，可能需要結(jié)合中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、中藥化學(xué)物質(zhì)組、基因組、蛋白質(zhì)組和代謝組等方法進(jìn)一步展開研究。