吳澤英

(山地植物資源保護與種質創(chuàng)新教育部重點實驗室(貴州大學)，貴陽，550025)

李正春 文曉鵬

(貴州省森林資源與環(huán)境研究中心(貴州大學))(山地植物資源保護與種質創(chuàng)新教育部重點實驗室(貴州大學))

馬尾松(PinusmassonianaLamb)為松科松屬高大喬木，是我國特有、植被面積最大的產脂樹種[1]。松脂是一類萜類混合物，由松節(jié)油和松香組成，可作為生物燃料、醫(yī)藥、化妝品和食品工業(yè)的原料[2]。萜類化合物組成的基本單位是異戊二烯(C5)，根據C5數目可將萜類化合物分為單萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)等，松節(jié)油的主要成分是單萜和倍半萜化合物，松香的主要成分是樹脂酸，是一類二萜化合物的異構體混合物[3-4]。松脂富含的萜類化合物主要由丙酮酸途徑(MEP)和甲羥戊酸途徑(MVA)合成[5]。

3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A合酶(HMGS)是MVA途徑的關鍵酶，能催化1分子乙酰輔酶A與1分子乙酰乙酰輔酶A縮合成3-羥基-3甲基戊二酰CoA，隨后在羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)的催化下生成甲羥戊酸(MVA)，MVA經一系列酶的磷酸化和脫羧作用生成異戊烯基焦磷酸(IPP)，從而為單萜、半萜和二萜等化合物的合成提供通用前體[5]。如今HMGS基因已在許多植物被分離和鑒定，如思茅松[3]、竹葉花椒[6]、銀杏[7]和檀香[8]等。關于馬尾松HMGS基因，有報道其表達量與松脂產量有相關性[2]，但馬尾松參與萜類生物合成的HMGS基因未被鑒定?；隈R尾松HMGS基因未被克隆鑒定，本研究首次克隆馬尾松PmHMGS的cDNA全長序列，對序列進行生物信息學分析，并采用實時熒光定量檢測PmHMGS在幼年樹不同組織、機械損傷和茉莉酸甲酯處理不同時間下的表達情況，以期為進一步探討馬尾松PmHMGS在萜類代謝途徑中的分子調控機制提供基礎理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

試驗植物材料為1.5年生和2年生的馬尾松實生苗。種子采自貴州都勻馬尾松國家林木良種基地，在貴州大學農業(yè)生物工程研究院實驗室培育而得。

茉莉酸甲酯(MeJA)處理：選健康長勢一致的1.5年生馬尾松苗，參照文獻[9]的方法配置MeJA溶液和處理苗，用10 mmol/L的MeJA溶液分別噴施苗0、6、24、48 h；機械損傷處理為2年生長勢一致的苗，在地上部10 cm處莖段切割長2 cm，寬為1/2莖環(huán)的傷口，分別處理0、2、6、12、24、48 h。每個處理3個生物學重復，在相應的時間點取全木質化的莖，液氮速凍，冰箱中-80 ℃保存。組織特異性分析取材：選3株生長良好一致的1.5年生馬尾松苗，取成熟葉、全木質化莖和根，液氮速凍，冰箱中-80 ℃保存。

1.2 馬尾松RNA提取與cDNA合成

參照艾德萊RN38總RNA提取試劑盒說明書，提取根、莖、葉和不同處理下莖的總RNA。用酶標儀(Thermo Scientific,USA)檢測RNA的濃度。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA的純度和完整性。選擇完整且濃度達標的RNA，用TakaRa公司反轉錄試劑進行反轉錄，合成cDNA第一鏈。用內參基因SKI質檢cDNA，合格的cDNA稀釋5倍后存放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因的cDNA全長克隆

基于馬尾松高、低產脂轉錄組數據的HMGS序列，用Primer Primer5.0設計特異性克隆引物PmHMGS-F和PmHMGS-R(表1)，以莖的cDNA為模板，用PrimeSTAR高保真聚合酶進行擴增得到PmHMGS基因的cDNA片段。PCR反應體系為：5 μL的PrimeSTAR，3.5 μL的ddH2O，1 μL的cDNA，0.5 μL的正反引物。反應程序為：98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，4 ℃保存。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和膠回收PCR產物。將目的片段鏈接到pEASY-Blunt克隆載體上，經菌落PCR檢測，挑取陽性單菌落送生物工程(上海)股份有限公司測序。測序獲得的序列經拼接、比對分析，得到PmHMGS基因的cDNA全長序列。

表1 PmHMGS基因的RT-PCR和qRT-PCR引物

1.4 基因的生物信息學分析

將克隆得到的PmHMGS基因序列提交到NCBI的ORF Finder預測開放閱讀框，獲得蛋白序列；通過ProtParam、TMHMM 2.0、SignalP4.1 Server、PSORT、SOPMA、SWISS-MODEL、CLUSTLWZA、ENDscript/ESPript在線網站和MAGA 7.0本地軟件分析PmHMGS蛋白質的理化性質、跨膜結構域、信號肽、亞細胞定位、二級結構、三級結構、同源性比較和構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 基因的表達分析

根據PmHMGS基因序列，用Primer5.0設計熒光引物PmHMGS-qF和PmHMGS-qR，見表1。以SKI為內參基因，通過qRT-PCR方法檢測PmHMGS基因在不同組織、不同處理下的表達情況。反應程序：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共35個循環(huán)。3個技術重復和3個生物學重復。

1.6 數據處理

用算法2-ΔCt計算基因的相對表達量，Excel2016處理數據，SPSS 22.0軟件分析數據的顯著性。

2 結果與分析

2.1 PmHMGS基因的cDNA全長克隆

通過PCR擴增PmHMGS基因，產物如圖1所示，擴增條帶在1 500 bp左右，條帶位置、大小符合預期，可分離純化產物送公司進行測序。

M為Marker;1、2、3、4為PmHMGS的cDNA全長。

2.2 PmHMGS基因的生物信息學分析

通過ORF Finder網站分析顯示，PmHMGS基因的ORF為1 425 bp，編碼474個氨基酸，與轉錄組HMGS基因序列的ORF一致，命名為馬尾松3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因(PmHMGS)。

ProtParam在線軟件預測PmHMGS蛋白的理化性質顯示，PmHMGS蛋白的分子式為C2357H3656N618O724S23；相對分子質量為52 972.04，理論等電點為5.61。帶負電氨基酸殘基總數為59，帶正電氨基酸殘基總數為50。不穩(wěn)定系數為44.34，表明PmHMGS為不穩(wěn)定蛋白質。其脂肪族氨基酸指數為76.98，總的親疏水性平均系數為-0.28，表明該蛋白質為親水性蛋白。

SignalP4.1 Server分析顯示PmHMGS蛋白不含信號肽；THMM2.0在線工具對蛋白序列跨膜結構進行分析，發(fā)現PmHMGS未形成跨膜結構域；利用Cell-PLoc 2.0在線軟件進行亞細胞定位預測，結果表明該蛋白定位于細胞質。萜類代謝MVA途徑存在于細胞質中，這3種預測結果可以推斷馬尾松PmHMGS酶在細胞質中合成后，不進行蛋白轉運，而是留在細胞質中直接與代謝底物作用，參與萜類化合物的合成。

利用Pfam和NCBI的CD Search網站分析PmHMGS蛋白的保守結構域，CD Search結果顯示該蛋白含典型的HMGS活性結構域(圖2)，Pfamh網站預測到該蛋白保守結構域的N末端位于第4～176位點，C末端為第178～452位點。

圖2 馬尾松PmHMGS蛋白的保守結構域預測

應用SOPM在線網站預測馬尾松PmHMGS蛋白的二級結構，結果表明該蛋白二級結構中有46.20%的氨基酸殘基為α-螺旋(H)，13.08%的氨基酸殘基為β-螺旋(E)，4.64%的氨基酸殘基為β-轉角(T)，36.08%的氨基酸殘基為無規(guī)則卷曲(C)。用SWISS-MODEL預測該蛋白的三維結構(圖3)，以擬南芥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合酶(PDB NO:2fa3.1.A)的三維結構為模板來建模，序列相似性為74.33%。

圖3 馬尾松PmHMGS蛋白三級結構的預測

將PmHMGS蛋白序列放在NCBI的Blast中檢索，下載同源性較高的不同物種序列，用在線軟件CLUSTLWZA比對分析，ENDscript/ESPript對分析結果作圖。結果顯示(圖4)，馬尾松PmHMGS蛋白序列與樟子松的PsHMGS蛋白序列同源性為99.58%，與思茅松的PkHMGS蛋白序列同源性為99.37%，與曼地亞紅豆杉的TmHMGS蛋白序列同源性為84.18%，與銀杏GbHMGS蛋白序列同源性為81.95%。從圖中可知，馬尾松PmHMGS蛋白與其他已知功能植物的HMGS蛋白功能結構域幾乎一致，有活性中心“NXD/NE/vEGI/vDx(2)NACF/yxG”保守基序和5個參與底物催化的保守活性氨基酸位點，分別為Glu86、Cys120、Ser251、Gly328和Ser362[7]。這一結果表明HMGS蛋白的功能結構域在分子進化中具有較高的穩(wěn)定性和保守性。

用MEGA7.0軟件對馬尾松、樟子松、思茅松等15種植物的HMGS蛋白序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，研究HMGS蛋白之間的序列多樣性和進化關系。結果如圖5所示，馬尾松的PmHMGS蛋白與樟子松、思茅松、曼地亞紅豆杉和銀杏的HMGS蛋白序列聚為一支，它們都屬于裸子植物。其中馬尾松HMGS與樟子松HMGS親緣關系最近，其次是思茅松，這與植物的物種分類一致，反映了植物HMGS的進化保守性和進化多樣性。

藍色方框為PmHMGS蛋白的活性中心；黑色五角星為HMGS蛋白活性位點；PsHMGS為樟子松蛋白序列(CAA65250.1)；PkHMGS為思茅松蛋白序列(QLL99514.1)；TmHMGS為曼地亞紅豆杉蛋白序列(AAT73206.1)；GbHMGS為銀杏蛋白序列(AWG97032.1)。

圖5 馬尾松PmHMGS蛋白的系統(tǒng)進化樹

2.3 PmHMGS基因的表達分析

利用qRT-PCR技術分析PmHMGS基因在馬尾松不同組織、茉莉酸甲酯和機械損傷處理不同時間下莖的表達情況，結果顯示(表2～表4)，PmHMGS基因在根、莖、葉中有差異表達，在莖中表達量最高，其次為根和葉，兩者表達量大致相同。茉莉酸甲酯處理后，馬尾松莖中PmHMGS的表達量隨著MeJA處理時間增加而增加，在處理48 h時，PmHMGS仍然響應的MeJA的誘導表達，是未處理的5.6倍。機械損傷處理后，PmHMGS基因在莖中的相對表達先升后降，在12 h時達到最大值，是未處理的10.17倍。

表2 PmHMGS基因在葉、莖、根中的相對表達量

表3 茉莉酸甲酯處理不同時間下PmHMGS基因在莖中的相對表達量

表4 機械損傷處理不同時間下PmHMGS基因在莖中的相對表達量

3 討論與結論

松脂產量是一個高度遺傳的性狀，通過傳統(tǒng)的育種方法可以獲得大量的遺傳收益，但傳統(tǒng)方法過程十分緩慢[10]。另外，馬尾松產脂性狀還受生物、非生物脅迫和氣候等因素的影響，讓傳統(tǒng)育種工序變得更繁瑣[11]。目前隨著轉錄組測序技術的發(fā)展，挖掘和研究高產脂相關的基因，從基因工程的角度來獲得高產脂品種或創(chuàng)造高產脂種質馬尾松的研究也越來越成為研究熱點[12]。

HMGS是MVA途徑中萜類生物合成類異戊二烯的限速酶，類異戊二烯是所有萜的C5前體[13]。目前HMGS已在許多植物被克隆和鑒定，而馬尾松HMGS的研究相對空缺。本研究首次從馬尾松克隆并鑒定了MVA通路中編碼HMGS的PmHMGS基因，且分析了它的組織表達水平?？寺〉鸟R尾松HMGS基因的cDNA全長為1 425 bp，命名為PmHMGS。推導的PmHMGS蛋白含有474個氨基酸，蛋白相對分子質量為52 972.04，這與報道的植物HMGS蛋白一般由460到500個氨基酸殘基組成，相對分子質量為50 000到60 000一致[14]。保守結構域及多序列分析表明，PmHMGS基因與其他植物HMGS基因具有高度的相似性，含有典型的HMGS蛋白保守結構域，即保守基序“NXD/NE/vEGI/vDx(2)NACF/yxG”和5個活性氨基酸位點“Glu86、Cys120、Ser251、Gly328、Ser362”，暗示PmHMGS可能具有其他植物HMGS的功能[7]。系統(tǒng)進化樹分析表明，PmHMGS蛋白與屬裸子植物的樟子松、思茅松、曼地亞紅豆杉和銀杏的HMGS蛋白序列聚為一支，其中PmHMGS與樟子松的PsHMGS親緣關系最近，表明HMGS在不同植物中具有進化起源的保守性，并表現出氨基酸序列和功能結構域的保守性。

HMGS基因在不同植物中的表達模式存在差異，且萜類化合物的產量與HMGS基因表達的組織特異性相關。如檀香的SaHMGS在根中表達量最高，其次是心材，根和心材是提取精油(倍半萜化合物)的主要部位[8]；銀杏GbHMGS1在葉和果實高表達，葉和果實是地上器官中生產萜類化合物和保護免受太陽輻射的主要部位[7]；洋甘菊McHMGS在花中表達量最高，且花中主要倍半萜的含量顯著高于其他組織[13]。本研究對PmHMGS基因組織特異性表達分析發(fā)現，在1.5年生馬尾松的莖中表達量最高，葉和根的表達量相近，與已報道的馬尾松HMGS基因在樹干木質部中與松脂產量成正相關，在成熟葉中與松脂產量呈負相關相符[2]，推測PmHMGS主要在莖中調控萜類化合物的合成。但與思茅松的PkHMGS的表達有出入，其在針葉中高表達[3]。茉莉酸甲酯是一種小信號分子，在外源作用下可以調控植物的次生代謝[14]。MeJA與萜烯代謝密切相關，如MeJA處理提高了檀香SaHMGS、洋甘菊McHMGS、果香菊CnHMGS的表達量，相應的萜類化合物檀香醇、洋甘菊倍半萜類、果香菊倍半萜類的含量也增加[8，15-16]。本實驗發(fā)現MeJA處理馬尾松后，莖中的PmHMGS基因表達水平顯著升高，與檀香SaHMGS在莖中響應MeJA的表達模式相似，說明PmHMGS應答MeJA的誘導表達，從而可能增加馬尾松萜類化合物的合成。樹脂道是生產、儲存和運輸松脂的復雜網絡，遍布于針葉樹的根、莖、針葉和球果中[17]。當松脂管道受機械損傷、昆蟲攻擊和病原體入侵等非生物或生物刺激破壞，樹脂道被切斷并釋放樹脂防御傷害，同時新生分化創(chuàng)傷性樹脂道，也正調控或負調控基因的表達，從而激活或抑制酶的活性，影響代謝物的積累[18]。如以下?lián)p傷處理后：紫莖澤蘭的倍半萜烯合酶基因EaTPS1的表達被抑制，卡迪寧(倍半萜化合物)得以大量積累[19]；興安落葉松防御系統(tǒng)的多酚氧化酶(PAL)和內苯丙氨酸解氨酶(PPO)的活性增強[20]；思茅松PkHMGS上調表達，在高、低產脂思茅松高表達分別是損傷處理12 h時和6 h[3]。試驗發(fā)現PmHMGS也響應機械割傷脅迫，在損傷處理12 h時，PmHMGS的表達量達到最大值，與PkHMGS在高產脂思茅松表達模式相似，但與低產脂的PkHMGS表達不同，說明不同種質、不同產脂力的針葉樹，HMGS基因對脅迫刺激信號的感知能力不同。綜合表明，馬尾松PmHMGS基因可能同上述響應MeJA和機械損傷處理的基因一樣，調控萜類代謝物的合成，本研究為后續(xù)深入探討PmHMGS基因在馬尾松松脂合成中的功能提供基礎理論依據。