周芳 陳林 譚小武 曾賽麗 肖玉蓉 邵春

(南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，湖南 衡陽 421001)

紫蕪菁是十字花科蕓薹屬蕪菁種可食用植物，在新疆是藥食兩用植物。研究發(fā)現(xiàn)，紫蕪菁乙醇提取物在體外有較強的抗氧化作用，可改善過氧化氫(H2O2)誘導的人腸上皮Caco-2細胞氧化損傷，抑制炎癥因子白細胞介素(IL)-8和IL-1β的分泌〔1〕。研究表明高寒山區(qū)蕪菁有抑菌作用，新疆蕪菁有止咳、平喘、祛痰的藥理作用〔2，3〕。紫蕪菁乙醇提取物對H2O2誘導肺上皮細胞的作用及其保護機制還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)miR-223-3p在小鼠肺上皮細胞中表達下調(diào)可能與嚴重肺部炎癥相關〔4〕。研究表明，IL-1β通過激活核轉錄因子(NF)-κB信號途徑介導了肺上皮細胞A549分泌炎性因子IL-8〔5〕。本研究假設紫蕪菁乙醇提取物可通過miR-223-3p調(diào)控肺上皮細胞內(nèi)NF-κB信號途徑介導IL-8表達，影響H2O2誘導的肺上皮細胞的增殖和凋亡。本研究以H2O2誘導的肺上皮細胞A549細胞為模型，以低、中、高3種濃度紫蕪菁乙醇提取物處理模型細胞，上調(diào)或下調(diào)miR-223-3p的表達來檢測紫蕪菁乙醇提取物對模型細胞增殖和凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料 人肺上皮細胞A549購自美國ATCC；新鮮紫蕪菁購自植物研究所；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，放射免疫沉淀試驗(RIPA)細胞裂解液、胰蛋白酶Trypsin、四甲基偶氮唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司；細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體、IL-8抗體、p-IκBα抗體和β-actin抗體購自英國Abcam公司；miR-223-3p模擬物(miR-223-3p)、miR-223-3p抑制物(anti-miR-223-3p)和陰性對照(miR-NC和anti-miR-NC)購自蘇州吉瑪基因；雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白含量檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；流式細胞儀購自美國BD公司，實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和實驗分組〔1〕細胞培養(yǎng)：將A549細胞培養(yǎng)在含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中添加1%青霉素+1%鏈霉素，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，消化傳代。紫蕪菁乙醇提取物處理：根據(jù)文獻〔1〕進行紫蕪菁乙醇提取物的制備，將可食用部分真空冷凍干燥，粉碎后過60目篩。每100 g蕪菁粉用500 ml乙醇浸提6 h然后離心，真空低壓蒸發(fā)后即制成紫蕪菁乙醇提取物，除菌后-80℃保存。

實驗分為NC組、H2O2組、50、100、200 μg/ml紫蕪菁乙醇提取物+H2O2組、轉染物+H2O2組和轉染物+紫蕪菁乙醇提取物+H2O2組。NC組：為常規(guī)培養(yǎng)的A549細胞；H2O2組：用含150 μmol/L H2O2的培養(yǎng)液37 ℃ 條件下誘導培養(yǎng)A549細胞4 h；各劑量紫蕪菁乙醇提取物+H2O2組：A549在37℃條件下用H2O2誘導培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，添加含50、100、200 μg/ml紫蕪菁乙醇提取物的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；H2O2+轉染組：A549用H2O2誘導培養(yǎng)4 h，然后轉染miR-223-3p或anti-miR-223-3p；轉染物+紫蕪菁乙醇提取物+H2O2組：A549用H2O2誘導培養(yǎng)4 h，紫蕪菁乙醇提取物200 μg/ml培養(yǎng)24 h，然后轉染anti-miR-223-3p。

1.2.2MTT比色法測定細胞存活率 根據(jù)1.2.1方法處理A549細胞，收集細胞，以2×103個細胞/孔接種于96孔板中培養(yǎng)48 h，進行MTT實驗，每孔加入20 μl MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄去上清培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO溶解結晶，室溫振蕩5 min，酶標儀測定OD490 nm 處的吸光度(A)值。細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.2.3流式細胞術測定細胞凋亡率 將根據(jù)1.2.1方法處理后的各組A549細胞，以每孔2×104個細胞接種于6孔板中，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，胰蛋白酶消化細胞，按凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，上流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.2.4Western印跡檢測蛋白表達 收集根據(jù)1.2.1方法處理后的各組A549細胞，用RIPA裂解液重懸細胞，超聲破碎后收集蛋白，試劑盒測定總蛋白濃度。將樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(CyclinD1抗體1∶2 000、酶切caspase-3抗體1∶1 000、IL-8抗體1∶2 000、p-IκBα抗體1∶1 000和β-actin抗體1∶3 000)，4℃孵育過夜，洗膜2次，加入稀釋的酶標二抗室溫孵育1 h，顯影，掃描，以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白表達水平。

1.2.5細胞轉染 待A549細胞培養(yǎng)至細胞融合為一層時，將細胞稀釋為1×106個/ml，以每孔200 μl接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞融合度達到80%時按照Lipofectamine2000說明書進行轉染。將miR-223-3p、miR-NC、anti-miR-223-3p、anti-miR-NC分別轉染入A549 細胞，轉染48 h后收集細胞檢測miR-223-3p的表達情況，進行后續(xù)實驗。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1紫蕪菁乙醇提物對H2O2誘導的A549存活率和凋亡的影響 與NC組相比，H2O2組細胞存活率和CyclinD1水平顯著降低，凋亡率和酶切caspase-3水平顯著升高(均P<0.05)；與H2O2組相比，50、100、200 μg/ml紫蕪菁乙醇提物+H2O2組細胞存活率和CyclinD1水平顯著升高，凋亡率和酶切caspase-3水平顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)，見表1、圖1、圖2。

表1 紫蕪菁乙醇提物對H2O2誘導的A549存活率和凋亡的影響

1～5:NC組、H2O2組、50 μg/ml紫蕪菁乙醇提物+H2O2組、100 μg/ml紫蕪菁乙醇提物+H2O2組、200 μg/ml紫蕪菁乙醇提物+H2O2組；圖2、3同圖1 紫蕪菁乙醇提取物對H2O2誘導的A549細胞凋亡的影響

圖2 Western印跡檢測CyclinD1和酶切caspase-3蛋白表達

2.2紫蕪菁乙醇提物對H2O2誘導的A549細胞中IL-8、p-IκBα表達水平 與NC組相比，H2O2組IL-8和p-IκBα水平顯著升高(P<0.05)；與H2O2組相比，50、100、200 μg/ml紫蕪菁乙醇提物+H2O2組IL-8和p-IκBα水平顯著降低且呈劑量依賴性(均P<0.05)，見圖3、表2。選擇效果較為明顯的200 μg/ml紫蕪菁乙醇提取物濃度進行后續(xù)實驗。

圖3 Western印跡檢測IL-8 、p-IκBα 蛋白的表達

表2 Western印跡檢測IL-8 、p-IκBα 蛋白的 表達

2.3紫蕪菁乙醇提物對H2O2誘導的A549細胞中miR-223-3p表達水平的影響 H2O2組A549細胞中miR-223-3p水平(0.40±0.04)顯著低于NC組(1.02±0.11，P<0.05)；200 μg/ml紫蕪菁乙醇提物+H2O2組A549細胞中miR-223-3p含量(0.86±0.09)顯著高于H2O2組(P<0.05)。

2.4過表達miR-223-3p對H2O2誘導A549細胞存活率、凋亡和IL-8、p-IκBα表達水平的影響 與miR-NC+H2O2組相比，miR-223-3p+H2O2組A549細胞存活率、miR-223-3p、CyclinD1水平均顯著升高，細胞凋亡率、酶切caspase-3、IL-8和p-IκBα水平均顯著降低(P<0.05)，見表3和圖4。說明過表達miR-223-3p可提高細胞存活率，抑制細胞凋亡。

表3 過表達miR-223-3p對H2O2誘導人肺上皮細胞A549存活率、凋亡和IL-8、p-IκBα表達水平的影響

圖4 Western印跡檢測CyclinD1、酶切caspase-3、 IL-8 、p-IκBα 蛋白的表達

2.5下調(diào)miR-223-3p對H2O2誘導A549細胞的存活率、凋亡和IL-8、p-IκBα表達水平的影響 與anti-miR-NC+H2O2組相比，anti-miR-223-3p+H2O2組A549細胞存活率、miR-223-3p、CyclinD1水平均顯著降低，細胞凋亡率、酶切caspase-3、IL-8和p-IκBα水平均顯著升高(P<0.05)，見圖5和表4。

圖5 Western印跡檢測CyclinD1、酶切caspase-3、 IL-8、p-IκBα 蛋白的表達

表4 下調(diào)miR-223-3p對H2O2誘導人肺上皮細胞A549的存活率、凋亡和IL-8、p-IκBα表達水平的影響

2.6下調(diào)miR-223-3p可以逆轉紫蕪菁乙醇提物對H2O2誘導A549細胞的存活率、凋亡和IL-8、p-IκBα表達水平的影響 與anti-miR-NC+紫蕪菁乙醇提物+H2O2組相比，anti-miR-223-3p+紫蕪菁乙醇提物+H2O2組A549細胞存活率、miR-223-3p、CyclinD1水平顯著降低，細胞凋亡率、酶切caspase-3、IL-8和p-IκBα 水平顯著升高(P<0.05)，見表5和圖6。說明下調(diào)miR-223-3p可逆轉紫蕪菁乙醇提取物對H2O2誘導A549細胞的存活率、凋亡和IL-8、p-IκBα表達水平的影響。

表5 下調(diào)miR-223-3p可以逆轉紫蕪菁乙醇提物對H2O2誘導人肺上皮細胞A549的存活率、凋亡和 IL-8、p-IκBα表達水平的影響

1～2：anti-miR-NC+紫蕪菁乙醇提物+H2O2組、anti-miR-223-3p+紫蕪菁乙醇提物+H2O2組圖6 Western印跡檢測CyclinD1、酶切caspase-3、 IL-8 、p-IκBα 蛋白的表達

3 討 論

紫蕪菁是藥食兩用的植物，在全國范圍內(nèi)都有種植。研究表明，蕪菁的乙醇提取物、正丁醇提取物、水提取物、醚提取物等有止咳平喘〔6〕、降低血糖〔7〕、抗急性低壓缺氧損傷〔8〕、抗衰老〔9〕、抗氧化增強機體免疫力〔10〕等作用。本研究結果表明，H2O2抑制A549細胞增殖并促進細胞凋亡，促進Cyclin D1蛋白表達，降低酶切caspase-3蛋白表達；各劑量紫蕪菁乙醇提取物均可促進H2O2誘導的A549細胞增殖，并抑制細胞凋亡，200 μg/ml紫蕪菁乙醇提取物促增殖效果最好，證實了紫蕪菁乙醇提取物對H2O2誘導的A549細胞損傷有保護作用。但其具體機制尚不清楚。

研究顯示，miR-223-3p在大鼠肺動脈高壓(PAH)中表達下調(diào)，miR-223-3p高表達能減輕大鼠肺血管重塑，改善PAH病理特征〔11〕。miR-223-3p在肺鱗狀細胞癌(LSCC)組織中表達顯著下調(diào)，過表達miR-223-3p在體外抑制癌細胞增殖和遷移，在體內(nèi)可抑制腫瘤生長〔12〕。過表達miR-223-3p在機械通氣或金黃色葡萄球菌感染引起的急性肺損傷中起到保護作用，可能通過抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)1抑制急性肺損傷〔4〕。NF-κB信號通路參與肺部炎癥例如急性肺損傷、慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化等，介導炎性細胞因子的表達〔13〕。IκBα是IκB家族成員之一，IκB是NF-κB信號通路重要蛋白之一，炎癥發(fā)生后泛素化降解p-IκBα大量增多，持續(xù)激活NF-κB信號通路，產(chǎn)生IL-8等炎癥因子〔14〕。

綜上，紫蕪菁乙醇提取物通過上調(diào)miR-223-3p的表達，抑制NF-κB信號通路介導產(chǎn)生IL-8，促進H2O2誘導的肺上皮細胞A549增殖并抑制細胞凋亡，達到對A549細胞的保護作用。本研究只進行了體外細胞實驗，下一步將從體外動物模型試驗方面著手研究紫蕪菁乙醇提取物對A549細胞保護作用的具體分子機制，為肺部炎癥的臨床研究提供更多的數(shù)據(jù)支持。