張涵，趙瑩，仲榮榮，文才藝，孟顥光

(河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院 ，河南 鄭州 450002)

苦瓜枯萎病是由尖孢鐮孢菌苦瓜?；?Fusariumoxysporumf.sp.momordicae)侵染引起的一種土傳病害，具有發(fā)病快、危害嚴重以及防治困難等特點[1]。隨著近年來苦瓜種植面積不斷擴大，連作現(xiàn)象普遍，導致病害的發(fā)生日趨頻繁，嚴重影響苦瓜的產(chǎn)量和質(zhì)量，成為苦瓜種植業(yè)的重要限制因素[2-3]。目前，生產(chǎn)上對苦瓜枯萎病的防治主要是以化學防治為主[4]。但是，由于苦瓜枯萎病是典型的土傳維管束病害，常用的化學農(nóng)藥和防治方法難以達到理想的效果，生產(chǎn)上一般利用化學農(nóng)藥進行灌根或者土壤處理，長期使用容易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全等問題[5-6]。生物防治是植物病害綜合防治的重要措施之一，可通過有益微生物及其代謝產(chǎn)物調(diào)控植物微生態(tài)環(huán)境，直接或間接抑制植物病原菌生長繁殖等途徑以達到控制植物病害的目的，具有自然資源豐富、環(huán)境兼容性良好和改善土壤微生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點[7-8]。近年來，利用拮抗細菌來防治植物枯萎病的研究越來越多。孫正祥等[9]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)YZU-S149處理后，可顯著降低西瓜枯萎病的病情指數(shù)，防治效果為75.87%。許帥等[10]研究表明，貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)ZF128可以顯著促進馬鈴薯植株生長，控制馬鈴薯枯萎病的流行，防治效果為82.46%。郭康迪[11]從河南省土壤樣品中分離獲得一株綠針假單孢菌(Pseudomonascholoeaphtis)，對苦瓜枯萎病具有良好的防治效果。本研究從河南省南陽桐柏山景區(qū)土壤樣品中分離獲得一株可用于苦瓜枯萎病菌生物防治的生防細菌，并對其分類鑒定、抑菌活性、促生和生防效果進行了系統(tǒng)的研究，以期為苦瓜枯萎病的生物防治提供更多優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品 2019年9月，從河南省南陽桐柏山景區(qū)采集土壤樣品，并將所得樣品用自封袋封存于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試病原菌 試驗所需的植物病原真菌包括苦瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.momordicae)、玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)、蘋果輪紋病菌(Botryosphaeriadothidea)、小麥全蝕病菌(Gaeumannnomycesgraminisvar.tritici)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、小麥赤霉病菌(F.graminearum)和小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)，由河南農(nóng)業(yè)大學植物病害生物防治實驗室分離保存。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 試驗所需培養(yǎng)基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖(PDB)培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

1.1.4 供試苦瓜 試驗所需苦瓜品種為“如玉33號”，購置于福建農(nóng)科農(nóng)業(yè)良種開發(fā)有限公司。

1.2 土壤細菌的分離、純化

試驗參考郭康迪[11]所述的方法對采集的土壤樣品進行處理，利用無菌水對土壤樣品進行梯度稀釋后，分別吸取100 μL稀釋度為10-4和10-5的土壤懸浮液涂布平板，各處理重復3次，將涂布后的平板置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)1～2 d后，觀察菌落生長情況，用接種環(huán)挑取形狀、大小、顏色相異的單菌落在LB平板上劃線分離、純化，將純化后的細菌分離物用25%甘油在-20 ℃保存?zhèn)溆肹12]。

1.3 拮抗菌株的篩選

1.3.1 拮抗菌株的初篩 試驗選擇苦瓜枯萎病菌為靶標菌進行拮抗菌篩選，將靶標菌菌餅(d=5 mm)置于PDA平板中央，在距離菌餅約3 cm處劃線接種不同的土壤細菌分離物，將接種后的培養(yǎng)皿在28 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，以僅接種靶標菌為空白對照。培養(yǎng)5～7 d后，觀察并記錄不同細菌分離物的抑菌效果。

1.3.2 拮抗菌株的復篩 將靶標菌菌餅(d=5 mm)接種于平板中央，在距離菌餅兩邊約3 cm處劃線接種相同菌株，以僅接種靶標菌為空白對照，每個處理設(shè)置3個重復。7 d后，觀察并記錄不同細菌分離物的抑菌效果，從中挑出拮抗效果最佳的菌株進行下一步研究。

菌絲生長抑制率=(對照菌落半徑-處理菌落半徑)/對照菌落半徑×100%

1.3.3 菌株TB17發(fā)酵濾液活性測定 菌株TB17的無菌發(fā)酵液制備參考習慧君等[12]的方法，振蕩培養(yǎng)48 h后，發(fā)酵液在12 000 r·min-1條件下離心，上清液過濾后即為無菌發(fā)酵液。將無菌發(fā)酵液分別按1∶4和1∶9的體積比與PDA混合制作平板培養(yǎng)基，在平板培養(yǎng)基的中央接種苦瓜枯萎病菌菌餅(d=5 mm)，以未添加發(fā)酵液的培養(yǎng)基為對照。培養(yǎng)5～7 d后，觀察并記錄不同處理的苦瓜枯萎病菌菌落生長情況，菌絲生長抑制率計算公式同1.3.2所述。

1.3.4 菌株TB17拮抗譜測定 試驗方法同1.3.2，分別以玉米大斑病菌、蘋果輪紋病菌、小麥全蝕病菌、小麥紋枯病菌、小麥赤霉病菌和小麥根腐病菌為靶標菌進行菌株TB17拮抗譜的測定。

1.4 拮抗菌株TB17對苦瓜促生效果測定

將菌株TB17接種于LB培養(yǎng)液中，在28 ℃、180 r·min-1的搖床上培養(yǎng)24 h后得到TB17發(fā)酵液(107cfu·mL-1)。待苦瓜幼苗長出2片真葉時，將制備好的TB17發(fā)酵液按每株10 mL進行灌根接種，以接種LB液體培養(yǎng)基為對照，處理后的苦瓜苗在28～30 ℃溫室中培養(yǎng)，25 d后調(diào)查統(tǒng)計苦瓜株高、地上部分鮮質(zhì)量、根長和根鮮質(zhì)量等生理指標。

1.5 拮抗菌株TB17室內(nèi)盆栽防效測定

將苦瓜種子催芽后在室溫內(nèi)播種，待苦瓜幼苗長出兩片真葉時進行生防效果測定。菌株TB17發(fā)酵液的制備按1.4所述。試驗設(shè)置處理組和對照組。處理組：將苦瓜幼苗置于濃度為107cfu·mL-1的苦瓜枯萎病菌孢子懸浮液中浸根處理30 min，定植后在苦瓜根部灌根接種60 mL的TB17發(fā)酵液；對照組：用相同濃度的苦瓜枯萎病菌孢子懸浮液浸根處理30 min，定植后以未接菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行灌根。所有處理后的苦瓜幼苗在28～30 ℃的溫室中培養(yǎng)，試驗重復3次，每次各處理5株。根據(jù)苦瓜枯萎病發(fā)病等級分級標準，計算并統(tǒng)計病情指數(shù)和防治效果[13]。

病情指數(shù)=Σ(病株數(shù)×相應級數(shù))/總株數(shù)×最高級數(shù)×100%。

防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。

1.6 菌株TB17的分類鑒定

1.6.1 形態(tài)特征觀察 將菌株TB17在LB平板上劃線培養(yǎng)，待培養(yǎng)1～2 d后，觀察記錄菌落形態(tài)特征，然后挑取少許菌落進行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。

1.6.2 生理生化特征測定 試驗參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中描述的方法[14]，測定菌株TB17的碳源、氮源利用情況、硝酸鹽還原能力、分解淀粉、纖維素、有機磷和無機磷的能力、明膠液化和產(chǎn)嗜鐵素的情況等。

1.6.3 16S rRNA基因序列分析 菌株TB17發(fā)酵液制備同1.4所述，試驗利用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒進行菌株TB17 DNA提取，該試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。PCR擴增引物為27F(5′-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)；反應體系(25 μL)：2×Easy Taq Master Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，27F和1492R各1 μL，ddH2O補足25 μL；擴增程序為95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，59 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)35次；72 ℃ 10 min。PCR擴增結(jié)束后，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進行特異性檢測，切膠回收后送往北京擎科生物科技有限公司測序。將得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析，挑選與其親緣關(guān)系較近的序列構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

結(jié)果表明，試驗從南陽桐柏山景區(qū)采集的樣品中共分離獲得34株細菌分離物，經(jīng)初篩和復篩后獲得一株對苦瓜枯萎病菌具有較強抑菌活性的拮抗菌株，編號為TB17，其對苦瓜枯萎病菌的菌絲生長抑制率為59.03%(圖1)。

A：對照；B：菌株TB17和病原菌對峙培養(yǎng)。A:CK;B:Dual culture of strain TB17 and F.oxysporum f.sp.momordicae on PDA plate.圖1 菌株TB17對苦瓜枯萎病菌的抑菌作用Fig.1 Inhibition effect of strain TB17 to F.oxysporum f.sp.momordicae

2.2 菌株TB17發(fā)酵液的抑菌活性

試驗結(jié)果如圖2所示，菌株TB17發(fā)酵濾液對苦瓜枯萎病菌的生長具有明顯的抑制作用，其稀釋5倍和10倍的發(fā)酵濾液對苦瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制率分別為63.96%和54.95%。

A：對照；B：稀釋5倍的發(fā)酵濾液；C：稀釋10倍的發(fā)酵濾液。A:CK;B:Diluted fermentation filtrate by five-fold;C:Diluted fermentation filtrate by ten-fold.圖2 菌株TB17發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢菌生長的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of fermentation filtrate of strain TB17 on the growth of F.oxysporum f.sp.momordicae

2.3 菌株TB17的抑菌譜

試驗結(jié)果如圖3所示，菌株TB17不僅對苦瓜枯萎病菌具有較強的拮抗效果，對供試的玉米大斑病菌、蘋果輪紋病菌、小麥全蝕病菌等6株靶標病原真菌也具有一定的拮抗效果，表明該菌株具有廣譜的抗植物病原真菌活性。

1：玉米大斑病菌；2：蘋果輪紋病菌；3：小麥全蝕病菌；4：小麥紋枯病菌；5：小麥赤霉病菌；6：小麥根腐病菌。1:S.turcica;2:B.dothidea;3:G.graminis var.tritici;4:R.cerealis;5:F.graminearum;6:B.sorokiniana.圖3 菌株TB17的拮抗譜Fig.3 Antagonistic spectrum of strain TB17

2.4 菌株TB17對苦瓜的促生作用

試驗結(jié)果如表1所示，菌株TB17對苦瓜具有顯著的促生作用。菌株TB17處理后，其株高和根長與對照組相比分別增加了32.33%和24.39%，地上部分鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量分別增加了61.54%和122.76%。

表1 菌株TB17對苦瓜的促生作用Table 1 Plant growth promoting effect of strain TB17 on bitter gourd

2.5 菌株TB17對苦瓜枯萎病的盆栽生防效果

試驗結(jié)果如圖4所示，在苦瓜接種處理第14 d時，僅接種苦瓜枯萎病菌的對照組苦瓜出現(xiàn)葉脈發(fā)黃、整株萎蔫莖基部縊縮變褐、整株萎蔫甚至枯死等癥狀，平均病情指數(shù)高達86.67；經(jīng)菌株TB17處理后，苦瓜的平均病情指數(shù)為20，顯著降于對照組，防治效果為76.92%。

圖4 菌株TB17的盆栽生防效果Fig.4 Biocontrol effect of strainTB17 in pot experiments

2.6 菌株TB17的分類鑒定結(jié)果

2.6.1 菌株TB17形態(tài)學特征 在LB培養(yǎng)基上觀察到的菌株TB17形態(tài)特征如圖5-a所示，菌落形態(tài)呈不規(guī)則狀，淡黃色，不透明，有光澤；試驗對菌株TB17進行革蘭氏染色，結(jié)果如圖5-b(放大400倍)，菌株TB17革蘭氏染色后呈陽性，在顯微鏡下呈桿狀。

a：菌株TB17的菌落形態(tài)；b：菌株TB17的革蘭氏染色。a:Colony morphology of strain TB17;b:Gram staining of strain TB17.圖5 菌株TB17的形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics of strain TB17

2.6.2 菌株TB17的生理生化特征 生防菌株TB17的生理生化測定結(jié)果如表2所示，菌株TB17可以利用蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖和甘露醇為碳源，可利用精氨酸為氮源，分解有機磷、無機磷，還原硝酸鹽以及產(chǎn)H2S等。

表2 菌株TB17的生理特征測定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain TB17

2.6.3 菌株TB17的分子生物學鑒定 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖6所示，菌株TB17的16S rRNA基因序列長度為1 430 bp(GenBank登錄號：MZ950653)，NCBI比對分析結(jié)果表明，菌株TB17與短短芽孢桿菌B.brevis(HQ317191)的親緣關(guān)系最近，其同源性達到99.79%。結(jié)合形態(tài)學、生理生化特征，將菌株TB17鑒定為短短芽孢桿菌(如圖7)。

泳道1：16S rRNA基因片段；泳道2：陰性對照；泳道M：DL2000 Marker。 Lane 1:16S rRNA gene fragment;Lane 2:Negative control;Lane M:DNA marker DL2000.圖6 菌株TB17的16S rRNA基因PCR擴增結(jié)果 Fig.6 PCR amplification of 16S rRNA gene from strain TB17

圖7 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹Fig.7 Neighbor-joining phylogenetic tree of strain TB17 based on 16S rRNA gene sequences

3 討論

近年來，生防微生物及其制劑因具有安全、無污染和環(huán)境兼容性良好等優(yōu)點而廣泛應用于植物病害生物防治[15-16]。目前研究并應用較多的生防細菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)[17]，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)[18]、貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)[19]和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)[20]等。雖然土壤是生防細菌分離的主要來源，但隨著大量生防菌資源的不斷挖掘，從一般的土壤生境中篩選獲得微生物新物種越來越困難。因此，越來越多的學者開始從濕地[21]、赤泥地[22]和高寒草地[23]

等特殊土壤生境進行微生物資源挖掘。河南省南陽桐柏山地處暖溫帶向亞熱帶過渡的地區(qū)，擁有完整的過渡帶森林生態(tài)系統(tǒng)和良好的自然生態(tài)[24]，是發(fā)掘新型微生物資源的適宜生境。我們從河南省南陽桐柏山景區(qū)的山地土壤樣品分離出34株具有拮抗活性的細菌純培養(yǎng)，經(jīng)初篩和復篩后，獲得1株對苦瓜枯萎病菌具有穩(wěn)定拮抗活性的生防菌株TB17，并將其鑒定為短短芽孢桿菌。該菌株對苦瓜枯萎病的盆栽防治效果達76.92%，同時可以有效促進苦瓜的生長，具有研發(fā)防治苦瓜枯萎病微生物菌劑的潛力。

研究表明，短短芽孢桿菌作為一種具有廣譜抗真菌活性的生防微生物，在其生長代謝過程中能夠產(chǎn)生不同的抗菌活性物質(zhì)來抑制病原菌的正常生長，進而達到控制病害的目的[25-28]。王潔等[29]從短短芽孢桿菌發(fā)酵液中分離純化獲得一種相對分子量為32 kD的鞭毛蛋白，對小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌等具有顯著抑菌效果；WAFAAG[30]從草莓植株葉際分離得到一株抗草莓灰霉病的短短芽孢桿菌，其產(chǎn)生的活性物質(zhì)短桿菌肽S(gramicidin S)可顯著降低草莓灰霉病的發(fā)生。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)菌株TB17的發(fā)酵液對苦瓜枯萎病菌的菌絲生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用，表明菌株TB17可以產(chǎn)生抗植物病原真菌的抑菌活性物質(zhì)，有關(guān)拮抗活性物質(zhì)的分離純化以及活性物質(zhì)對苦瓜枯萎病菌的抑制作用機制等問題尚有待于進一步深入研究。此外，在測定短短芽孢桿菌TB17的生防效果的同時，發(fā)現(xiàn)該菌株對苦瓜植株的促生效果顯著，該試驗結(jié)果是否與菌株TB17具有解磷作用和產(chǎn)嗜鐵素的功能有直接關(guān)系還有待于進一步研究。