夏艷輝，胡瑤君，孫夢(mèng)茹，郝鵬輝，畢亞寧，李宇，李洪連，王珂

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

水稻是全球最重要的糧食作物之一，養(yǎng)育著世界一半以上的人口，也是中國(guó)的第一大糧食作物[1]。河南省水稻的常年種植面積接近66.7萬hm2，是河南省的第三大糧食作物，河南省現(xiàn)有比較集中的稻區(qū)是沿淮和沿黃兩大稻區(qū)[2]。植物寄生線蟲危害水稻等多種農(nóng)作物，寄主范圍十分廣泛，且嚴(yán)重威脅糧食的安全生產(chǎn)[3]。目前，水稻線蟲病害日趨嚴(yán)重，在全世界每年造成約160億美元的損失[4-5]。

植物寄生線蟲是水稻上的一類重要病原物，水稻主要的寄生線蟲種類包括南方根結(jié)線蟲(MeloidogyneincognitaChitwood)、水稻潛根線蟲(HirschmanniellaoryzaeLuc and Goodey)、水稻莖線蟲(DitylenchusaugustusSeshadri and Dasgupta)、旱稻孢囊線蟲(HeteroderaelachistaOhshima)、水稻干尖線蟲(AphelenchoidesbesseyiChristie,)和菊花滑刃線蟲(A．ritzemabosiSchwartz)等[6]。水稻干尖線蟲又稱貝西滑刃線蟲(A．besseyiChristie)，是水稻上一種重要的植物病原線蟲，引起水稻干尖線蟲病，被列為全球危害最為嚴(yán)重的十大植物寄生線蟲之一[3、7]。該線蟲侵染水稻后，通常導(dǎo)致葉尖枯死，病部捻曲、歪攏，呈“干尖”狀，在中國(guó)南方稻區(qū)還造成“小穗頭”等癥狀，可直接造成水稻產(chǎn)量的大幅下降[8-9]。另外，水稻干尖線蟲也是典型的種傳病害，以成蟲或幼蟲潛伏在稻種和穎殼內(nèi)壁越冬，在水中和土壤中不能長(zhǎng)期生存，播種后線蟲游離到苗床，從芽鞘、葉鞘侵入幼苗的生長(zhǎng)點(diǎn)附近，以口針刺吸植物組織汁液進(jìn)行外寄生，隨著水稻生長(zhǎng)線蟲最終要游到穗部引起小穗癥狀從而導(dǎo)致減產(chǎn)，灌溉水和土壤傳播的范圍較小，而調(diào)運(yùn)稻種可將其遠(yuǎn)距離傳播。水稻干尖線蟲是一種世界分布廣泛的植物病原線蟲，各國(guó)水稻產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，可造成水稻10%～70%的產(chǎn)量損失[10]。水稻干尖線蟲寄主范圍廣，可以寄生35個(gè)屬200多種植物，主要危害水稻、粟、草莓，還可危害玉米、甘薯、大豆等多種農(nóng)作物及觀賞性植物[11-12]。水稻干尖線蟲最早于1915年在日本九州發(fā)現(xiàn)，在20世紀(jì)40年代由日本傳入中國(guó)天津，其后不斷擴(kuò)散蔓延，曾被中國(guó)列為對(duì)內(nèi)檢疫對(duì)象[13]。目前，中國(guó)各水稻產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，廣泛分布于安徽、浙江、遼寧、江蘇、福建、廣西、云南、貴州、四川、山東、廣東、湖南、河北、河南、天津、臺(tái)灣等地，局部地區(qū)危害嚴(yán)重[14-15]。目前，對(duì)水稻干尖線蟲的發(fā)生分布、病害癥狀、發(fā)生規(guī)律及防治措施等方面已做了較多的研究。XU等[16]對(duì)四川省2個(gè)水稻干尖線蟲種群的形態(tài)特征進(jìn)行了測(cè)量比較；OU等[17]通過形態(tài)學(xué)和分子技術(shù)，首次報(bào)道了在吉林省的水稻上發(fā)現(xiàn)了水稻干尖線蟲；黃金玲等[15]也利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)廣西分離的水稻線蟲進(jìn)行了種類鑒定；崔汝強(qiáng)等[18]通過快速分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)水稻干尖線蟲進(jìn)行了檢測(cè)和診斷；林茂松等[19]通過室內(nèi)鏡檢對(duì)江蘇水稻小穗頭上的線蟲蟲體進(jìn)行了形態(tài)鑒定，發(fā)現(xiàn)其測(cè)量數(shù)據(jù)與已報(bào)到文獻(xiàn)中水稻干尖線蟲的測(cè)量數(shù)據(jù)基本一致。目前，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方式鑒定水稻干尖線蟲河南種群的研究尚未見報(bào)道，僅在裴艷艷等[10]的報(bào)道中提及到來源于河南羅山縣的水稻干尖線蟲種群，并未見其對(duì)該種群的線蟲進(jìn)行具體的描述。黎少梅等[20]在河南省主要農(nóng)作物根際線蟲的調(diào)查中，在水稻上發(fā)現(xiàn)有水稻干尖線蟲，但缺乏相關(guān)的分子數(shù)據(jù)。

2020年8月，本研究在河南省開封市祥符區(qū)的水稻種植區(qū)發(fā)現(xiàn)有些水稻長(zhǎng)勢(shì)弱、葉尖干枯、呈“干尖”狀，采集了帶有病狀的稻株。室內(nèi)通過改良貝爾曼漏斗法和直接浸泡法從采集的水稻葉片中分離到了大量的植物線蟲，經(jīng)硫酸鏈霉素消毒后的線蟲接種于胡蘿卜愈傷組織進(jìn)行單雌培養(yǎng)，得到純化培養(yǎng)的群體KF-1。本研究擬采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)所采集的KF-1群體進(jìn)行種類鑒定，旨在明確河南省開封市水稻葉部植物線蟲的種類，進(jìn)而為水稻線蟲病害的診斷和防控提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與線蟲分離

2020年8月，在開封市祥符區(qū)杜良鄉(xiāng)的水稻種植區(qū)，采集干尖癥狀明顯的水稻地上部樣品。將發(fā)病的稻葉等帶回實(shí)驗(yàn)室后及時(shí)剪碎，采用改良的貝爾曼漏斗法進(jìn)行線蟲的分離[15]。

1.2 線蟲的純化培養(yǎng)

在體視顯微鏡下觀察收集的線蟲懸浮液，挑取活體線蟲，并將單條雌蟲消毒后接至胡蘿卜愈傷組織上，25 ℃培養(yǎng)30 d[21]，即可得到純培養(yǎng)的水稻線蟲KF-1群體，并挑取純化培養(yǎng)的單條線蟲進(jìn)行分子鑒定。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

體視顯微鏡下挑取純化培養(yǎng)后的線蟲置于玻片上的無菌水中，將線蟲熱殺死后，再挑至于4%的FG固定液(福爾馬林:甘油:蒸餾水體積比為10∶1∶89)中固定，采用甘油-乙醇脫水法脫水并制作永久玻片標(biāo)本[22]。使用配有軟件 NIS-Elements AR 的尼康光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse Ti-S)對(duì)制作的玻片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、數(shù)據(jù)測(cè)量和拍照。形態(tài)測(cè)量值的計(jì)算采用 De Man 公式，查閱有關(guān)文獻(xiàn)資料核對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)，確定其種類。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

依據(jù)王江嶺等[23]的方法對(duì)單條線蟲進(jìn)行DNA的提取。以上游引物18S(5’-TTGATTA-CGTCCCTGCCCTTT-3’)和下游引物26S(5’- TTTCACTCGCCGTTACTAAGG -3’)擴(kuò)增ITS區(qū)片段[24]；以上游引物D2A (5’-ACAAGTACCGTGA-GGGAAAGTTG-3’)和下游引物 D3B (5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’)擴(kuò)增28S rRNA基因中D2-D3區(qū)片段[25]。依據(jù)KOD FX DNA 聚合酶(TOYOBO)說明書配制反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性2 min；98 ℃ 變性10 s，58.2 ℃(ITS)或51.7 ℃(28S D2-D3)退火30 s，68 ℃ 延伸90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后，連接至克隆載體PJET1.2/blunt(Thermo Scientific)。轉(zhuǎn)化過程參考王碩等[26]的方法進(jìn)行，PCR檢測(cè)陽(yáng)性的菌液送公司測(cè)序，將獲得序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)中進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

測(cè)序結(jié)果拼接后提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，并下載與已提交的水稻干尖線蟲同源性較高的相關(guān)滑刃屬物種的ITS和28S rRNA基因中D2-D3區(qū)的序列，使用MEGA 7.0軟件中的Clustal W工具進(jìn)行序列比對(duì)分析[27]，利用Phylogeny.fr中的Gblocks選擇序列保守區(qū)，采用PAPU 4.0和MrModeltest 2.3在Akaike Information Criterion(AIC)標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行最優(yōu)核苷酸替代模型的選擇。使用MrBayes3.2構(gòu)建供試水稻干尖線蟲與其他滑刃屬線蟲ITS和28S rRNA基因中D2-D3區(qū)序列進(jìn)化樹[28]。貝葉斯分析中設(shè)定運(yùn)行代數(shù)Ngen=1 000 000，每100代生成一個(gè)樹sample freq=100，通過節(jié)點(diǎn)上的后驗(yàn)概率值來評(píng)估構(gòu)建的進(jìn)化樹，最后用Figtree v.1.3.1 軟件對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行查看和編輯。同時(shí)，用MEGA 7.0軟件統(tǒng)計(jì)其堿基組成，基于Kimura-2-paramater模型計(jì)算遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害的癥狀觀察

水稻葉片受害后，上部葉尖2～4 cm處干縮枯死，呈黃褐色或褐色，最后扭曲成灰白色干尖癥狀，病健交界處界線明顯(圖1)。

圖1 開封市水稻葉部線蟲病害的受害癥狀Fig.1 Symptoms of rice leaf disease caused by nematodes in Kaifeng City

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)純培養(yǎng)KF-1種群的雌雄蟲進(jìn)行了形態(tài)特征觀察和測(cè)量，測(cè)量值與還進(jìn)等[29]、FORTUNER[30]、林茂松等[17]報(bào)道的水稻干尖線蟲群體的測(cè)量數(shù)據(jù)基本一致，僅個(gè)別特征存在差異(表1,2)：雌雄蟲的體長(zhǎng)略小于FORTUNER[30]、還進(jìn)等[29]及林茂松等[19]報(bào)道的測(cè)量數(shù)據(jù)；雌蟲的a值略小于FORTUNER[30]報(bào)道的數(shù)據(jù)但與國(guó)內(nèi)報(bào)道數(shù)據(jù)無明顯差異；雌蟲的后陰子宮囊的長(zhǎng)度相比于還進(jìn)等[29]報(bào)道的數(shù)據(jù)較長(zhǎng)；另外，雄蟲的a值略大于國(guó)內(nèi)報(bào)道的數(shù)據(jù)及T值與FORTUNER[30]報(bào)道的數(shù)據(jù)相比較小。據(jù)此，我們初步將開封水稻線蟲KF-1群體鑒定為水稻干尖線蟲。

表1 水稻干尖線蟲KF-1群體雌蟲的形態(tài)測(cè)量值Table 1 Morphometrics data of Aphelenchoides besseyi KF-1 population females

對(duì)KF-1群體進(jìn)行形態(tài)特征拍照觀察，光學(xué)顯微照片見圖2，形態(tài)特征描述如下：

雌蟲：殺死固定后蟲體直或略向腹面彎曲，蟲體纖細(xì)(圖2-A)，頭架骨化較弱，向后延伸且唇區(qū)明顯縊縮，口針較細(xì)弱，長(zhǎng)11.9～12.6 μm，口針基部略膨大(圖2-E、F、G)；蟲體常有4條側(cè)線，其寬約為體寬的1/4(圖2-L)；中食道球?yàn)槁褕A形，瓣門明顯，排泄孔常位于神經(jīng)環(huán)的前緣附近(圖2-B)；陰門橫裂且陰唇稍突出(圖2-M)，受精囊呈長(zhǎng)卵形，通常聚集有精子(圖2-D)；卵巢較短，通常不延伸至食道腺末端，卵母細(xì)胞排列2～4行(圖2-H)；后陰子宮囊較窄，其長(zhǎng)度是陰門處體寬的2～3.2倍，但不超過肛陰距的1/3(圖2-D)；尾長(zhǎng)32.4～39.7 μm，尾部呈圓錐形，末端通常有1個(gè)尾突，且尾突上有3～4個(gè)小尖突(圖2-N、O、P)。

雄蟲：熱殺死固定后蟲體尾部向腹面彎曲呈鉤狀，蟲體似“J”型(圖2-Q)，體前端的形態(tài)與雌蟲基本類似。雄蟲單精巢、前伸，末端明顯(圖2-I)，尾端呈圓錐形且與雌蟲相似，也是星狀尾，末端有1個(gè)尾突，尾突上有小尖突；交合刺玫瑰刺形狀，無頂尖，交合刺長(zhǎng)約17.5～20.0 μm(圖2-J、K)。

表2 水稻干尖線蟲KF-1群體雄蟲的形態(tài)測(cè)量值Table 2 Morphometrics data of Aphelenchoides besseyi KF-1 population males

雌蟲:A,整體;B,體前部;C,食道腺;D,受精囊和后陰子宮囊(V=Vulval);E～G,頭部(S=stylet;Stb = stylet knob);H,生殖腺末端;L,側(cè)區(qū) (LF=Lateral Field);M,陰門 (V=Vulval);N～P,尾部 (M=mucro)。雄蟲,Q,整體;I,精巢末端 (Aet=Anterior end of testis);J～K,尾部 (DL=dorsal limb;Cn=condilus)。Females:A,Entire body;B,Anterior region;C,Pharyngeal gland;D,Spermatheca and post-uterine sac region (V=Vulval);E-G,Lip region (S=stylet;Stb = stylet knob);H,End of genital gland;L,LF=Lateral field;M,Vulval region (V=Vulval);N-P,Tail region (M=mucro).Males,Q,Entire body;I,Aet=Anterior end of testis;J-K,Tail region (DL=dorsal limb;Cn=condilus).圖2 開封水稻干尖線蟲KF-1種群不同部位的光學(xué)顯微圖Fig.2 Optical micrographs of different positions of Aphelenchoides besseyi KF-1 population from Kaifeng city

2.3 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 分子生物學(xué)鑒定分析 滑刃屬種類之間的形態(tài)特征差異較小，近似種之間更是較難區(qū)分，僅依靠形態(tài)學(xué)鑒定方法難度較大且易出現(xiàn)誤差。因此，本研究繼續(xù)對(duì)開封市水稻上的KF-1群體進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定。對(duì)KF-1群體的rRNA-ITS和28S rRNA D2-D3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，獲得2條長(zhǎng)度分別為826 bp和787 bp的片段(圖3)。在NCBI 比對(duì)分析顯示，KF-1群體的rRNA-ITS序列(MW216945)與水稻干尖線蟲種群(KP757373、KP757372、KP757371)的序列相似性最高，為100%；KF-1群體的 28S rRNA D2-D3序列(MW219225)與水稻干尖線蟲種群(KY123700、KY123696 )的序列相似性最高，為98.98%。

2.3.2 遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育分析 以MEGA 7.0軟件中的K2P模型計(jì)算水稻干尖線蟲種內(nèi)以及4種滑刃屬線蟲種間的遺傳距離。結(jié)果顯示，當(dāng)以ITS基因?yàn)榉肿訕?biāo)記時(shí)，水稻干尖線蟲與菊花葉枯線蟲、福建滑刃線蟲、草莓滑刃線蟲種間的遺傳距離分別為0.277、0.674和0.454且均大于2%，水稻干尖線蟲種內(nèi)的遺傳距離為0.004(<2%)，符合分子標(biāo)記鑒定物種的標(biāo)準(zhǔn)[31]，表明ITS基因可以準(zhǔn)確地從滑刃屬線蟲中區(qū)分出水稻干尖線蟲。當(dāng)以28S rRNA基因?yàn)榉肿訕?biāo)記時(shí)，水稻干尖線蟲與菊花葉枯線蟲、福建滑刃線蟲、草莓滑刃線蟲種間的遺傳距離分別為0.171、0.229和0.386均大于2%，水稻干尖線蟲種內(nèi)的遺傳距離為0.003(<2%)，亦符合分子標(biāo)記鑒定物種的標(biāo)準(zhǔn)，表明28S rRNA基因也可以準(zhǔn)確地從滑刃屬線蟲中區(qū)分出水稻干尖線蟲。

M:DNA 標(biāo)志DL 2000;1:DNA-ITS區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物;2:rRNA 28S D2-D3區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物。M:DNA Marker DL 2000;1:Amplification results of the DNA-ITS region of KF-1 population;2:Amplification results of the rRNA 28S D2-D3 region of KF-1 population.圖3 水稻干尖線蟲KF-1群體DNA-ITS和rRNA 28S D2-D3 Fig.3 PCR amplification results of the DNA-ITS and rRNA 28S D2-D3 region of Aphelenchoides besseyi KF-1 population

基于ITS和28S rRNA基因中D2-D3區(qū)序列構(gòu)建4種滑刃屬線蟲的系統(tǒng)進(jìn)化樹，ITS和 28S rRNA基因中D2-D3區(qū)序列以燕麥真滑刃線蟲(AphelenchusavenaeBastian,1865)為外群[32]，系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明(圖4、圖5)，以 ITS和28S rRNA基因中D2-D3區(qū)序列序列構(gòu)建的發(fā)育樹結(jié)果基本一致，即采集于開封市水稻病葉上的水稻干尖線蟲與相應(yīng)的滑刃屬種類聚在同一支。

注：超過50%的后驗(yàn)概率顯示在相應(yīng)的分支上，新獲得的序列加粗顯示。下同。Note：Posterior probabilities more than 50% are given for appropriate clades,newly obtained sequence is indicated in bold font.The same as below.圖4 基于4種滑刃屬線蟲rRNA-ITS區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogeny tree of 4 Aphelenchoides species based on partial rRNA-ITS sequences

圖5 基于4種滑刃屬線蟲28S rRNA基因D2-D3區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogeny tree of 4 Aphelenchoides species based on D2-D3 expansion segments of 28S rRNA gene sequences

3 結(jié)論與討論

根據(jù)水稻干尖線蟲種類的鑒別特征：口針長(zhǎng)度、尾部形態(tài)、唇區(qū)數(shù)、側(cè)線數(shù)等，本研究對(duì)河南省開封市水稻地上部分離到的線蟲KF-1群體進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定，將KF-1群體與國(guó)內(nèi)外水稻干尖線蟲群體進(jìn)行核查和對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)僅個(gè)別測(cè)量數(shù)據(jù)存在一些差異，主要形態(tài)特征均與之前報(bào)道的水稻干尖線蟲種群基本相符。究其原因，可能是線蟲種內(nèi)的變異引起，亦或是外界因素如土壤類型、地理位置及氣候條件等差異引起。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，利用分子生物學(xué)鑒定線蟲的方法已被廣泛應(yīng)用，該手段不僅彌補(bǔ)了線蟲表型差異對(duì)鑒定造成的影響，而且具有快速、準(zhǔn)確地鑒定線蟲種類的優(yōu)點(diǎn)[15]。目前，傾向于將種間遺傳距離相差2%(0.02)以上或種間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的10倍以上，作為物種鑒定有效的標(biāo)準(zhǔn)，該研究分別以2個(gè)分子標(biāo)記計(jì)算遺傳距離，結(jié)果顯示二者均符合以上標(biāo)準(zhǔn)[31]。本研究獲得的水稻干尖線蟲的ITS序列(MW216945)與數(shù)據(jù)庫(kù)中水稻干尖線蟲的ITS序列相似性為98.5%～100%，堿基變異數(shù)為1.5%，在以往報(bào)道的咖啡短體線蟲的種群內(nèi)ITS變異范圍以內(nèi)；獲得的水稻干尖線蟲的28S rRNA基因中D2-D3區(qū)序列(MW219225)與數(shù)據(jù)庫(kù)中水稻干尖線蟲的相應(yīng)序列相似性為93.43%～98.98%，堿基變異數(shù)達(dá)到5.55%。這種種內(nèi)差異比較常見，特別是28S rRNA基因中D2-D3區(qū)序列的種內(nèi)變異較大，造成這些差異的原因可能與不同種群所處的地理環(huán)境的不同有關(guān)[33]。

近年來，水稻干尖線蟲病害在中國(guó)水稻上的危害程度及發(fā)生范圍不斷加大，在各水稻主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生危害[14]，但目前國(guó)內(nèi)研究?jī)H對(duì)江蘇和四川水稻中分離的水稻干尖線蟲群體進(jìn)行了形態(tài)鑒定，對(duì)吉林和廣西分離的水稻干尖線蟲種群進(jìn)行了形態(tài)和分子鑒定[13，15-17，19]。雖然前人在河南省分離到水稻干尖線蟲種群，但缺乏水稻干尖線蟲相關(guān)的分子數(shù)據(jù)[20]。本研究對(duì)開封市祥符區(qū)杜良鄉(xiāng)水稻病葉分離到的KF-1群體進(jìn)行了種類鑒定，依據(jù)其形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，將采自開封的水稻線蟲的種鑒定為水稻干尖線蟲。另外，將獲得rRNA-ITS和28S rRNA基因中D2-D3區(qū)序列與已發(fā)表的同物種序列聚為高度支持的分支(Posterior probabilities=100%)，也證明本研究獲得的群體為水稻干尖線蟲。本研究進(jìn)一步對(duì)水稻干尖線蟲的種類鑒定信息進(jìn)行了補(bǔ)充和完善，同時(shí)也明確了在河南省水稻干尖線蟲已擴(kuò)散蔓延至河南省東部的水稻種植區(qū)，應(yīng)采取有效的措施，防止該線蟲病害的進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延。研究結(jié)果為水稻干尖線蟲病的診斷和防控提供了一定的科學(xué)依據(jù)。