陳 麗， 楊雯竹， 胡彩紅， 杜才富， 雷紹林

(1.貴州省油菜研究所， 貴陽 550081； 2.貴州省油料研究所， 貴陽 550006)

目前我國對油菜雜種優(yōu)勢的利用途徑主要有：細胞質雄性不育(CMS)、細胞核雄性不育(GMS)、化學殺雄(CH)和自交不親和(self-incompatibility)等，其中細胞質雄性不育因易于獲得全不育群體，有利于雜交制種而在生產上得到廣泛應用。常見的同源CMS有PolCMS、陜2 A CMS、NapCMS等；異源CMS有OguCMS、莫利CMS(MoricandiaCMS)、DiplotaxiscatholicaCMS、OxyrrhinaCMS等[1]，其中莫利CMS系統(tǒng)在印度芥菜型油菜生產上得到了廣泛應用[2-3]。

莫利CMS是Kirti P B、Prakash通過將Moricandiaarvensis(MM, 2 n=28)與Brassicjuncea(AABB, 2 n=36)進行體細胞融合(2 n=64,MMAABB),再用芥菜型油菜不斷回交，獲得的一種芥菜型油菜細胞質雄性不育系統(tǒng)[4-5],該胞質不育系統(tǒng)屬于配子體不育，育性穩(wěn)定且未發(fā)現(xiàn)其他胞質不良效應，其雜交種可育花粉與不育花粉各占50% ，但可育花粉量足夠滿足正常結實，對雜種產量并無影響[6]。目前研究表明，線粒體基因orf108-atpA共轉錄導致莫利CMS的雄性不育[7]，2015年Deepak等[8]將莫利CMS育性恢復基因定位在了A 09染色體，恢復基因的克隆工作仍在進行中。

一直以來，由于OguCMS具有不育徹底、易于保持的明顯優(yōu)勢，是較理想的雜種優(yōu)勢利用途徑[9-10]。然而由于國外專利保護，缺乏自有恢復源成為中國OguCMS 應用的主要技術障礙。目前國內關于莫利CMS在生產上應用的研究鮮有報道。本研究通過將莫利CMS引入甘藍型油菜，創(chuàng)制一批甘藍型油菜莫利 CMS材料，豐富了甘藍型油菜不育胞質類型。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料主要有芥菜型油菜莫利 CMS商品雜交種F1代，2013年由華中農業(yè)大學涂金星教授提供；用于回交的甘藍型油菜為貴州省油菜研究所穩(wěn)定自交系材料；作為參照的甘藍型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜取自貴州省油菜研究所油菜種質資源庫。

1.2 田間試驗

以芥菜型油菜莫利CMS商品雜交種F1代為母本，以甘藍型油菜自交系LZ 18001、LZ 18010等作為父本進行遠緣雜交。繼續(xù)以獲得的F1代雜種為母本，以甘藍型油菜優(yōu)良自交系為輪回親本連續(xù)回交5～6代，獲得甘藍型油菜莫利CMS候選株系若干。結合花粉活力鑒定結果以及套袋自交結實情況對候選株系進行回交、自交。同時對部分選育出的恢復系、不育系進行了雜交和自交，鑒定其恢復性。

1.3 花粉活力測定

采用醋酸洋紅染色測定法。取油菜花3朵，將每朵花的花粉置于載玻片上，用1%的醋酸洋紅染色液染色后蓋上蓋玻片(切勿壓片)，在光學顯微鏡下觀察計數(shù)(統(tǒng)計300個以上花粉粒)，大而圓且著色深的為可育花粉，小而癟且著色淺的為不育花粉。計算可育花粉個數(shù)占所觀察花粉總數(shù)的百分比，用來衡量植株花粉育性。

1.4 胞質分子標記檢測

采用CTAB小樣法提取基因組DNA[11]。本研究選用3個基于莫利CMS不育基因設計的特異引物orf108-O、orf108-N、orf108-B對轉育的甘藍型油菜莫利CMS材料以及其他胞質材料進行檢測。擴增程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

表1 甘藍型油菜莫利CMS鑒定分子標記引物序列Table1 Primer sequences for identification of Mori CMS in Brassica napus L. by molecular marker

2 結果與分析

2.1 甘藍型油菜莫利CMS不育系及恢復系材料的獲得

2013年秋播莫利CMS不育胞質商品雜交種F1代，2014年3月花期選株以甘藍型油菜材料作為父本進行第一輪去雄雜交，同年7月在貴州威寧縣夏繁進行第一輪回交獲得BC1種子。從2015—2016年正季和夏繁每年回交2代。2017年3月對獲得的BC5F1代株系分單株進行套袋自交和花粉鏡檢，同時繼續(xù)進行回交和雜交。

不育株獲得：BC5F1中株系CGZ 909出現(xiàn)部分單株花粉活力小于3%，且套袋自交完全不結實(圖1 A)；其他單株花粉活力在30%～80%之間，套袋自交不同程度部分結實(圖1 B、C、D)。使用甘藍型油菜自交系LZ 18010、LZ 18018、LZ 18022等對各不育株進行雜交，選擇母本自交完全不結實的單株雜交種繼續(xù)種植，并且對單株進行花粉活力鑒定以及套袋自交結實情況觀察。結果顯，株系CGZ 909不育徹底，植株雜交后代表現(xiàn)為較低的花粉活力以及徹底的套袋自交不結實性(圖1 E)，其余株系不育株的雜交后代仍表現(xiàn)出不一致的花粉活力并且存在部分結實現(xiàn)象。于是將株系CGZ 909中不育株作為甘藍型油菜莫利CMS候選不育系。

注：A為CGZ 909-7,花粉活力1.5%；B為CGZ 909-15,花粉活力44%；C為CGZ 909-25,花粉活力57%；D為CGZ 909-6,花粉活力76%；E為CGZ 909-7雜交F1代,花粉活力2%。圖1 甘藍型油菜莫利CMS部分不育株結實及花粉活力情況Fig.1 Seed setting and pollen viability of some sterile plants of Mori CMS in Brassica napus L.

可育株獲得：株系CGZ 924、CGZ 925的大部分單株花粉活力在90%以上，且套袋自交結實正常；其余株系花粉活力在50%～90%之間，套袋自交包括正常結實、部分結實植株。對套袋自交結實正常的植株后代繼續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)株系CGZ 924、CGZ 925的自交后代花粉活力在90%以上、套袋自交完全可育(圖2)。于是將株系CGZ 924、CGZ 925作為甘藍型油菜莫利CMS候選恢復系。

注：A為甘藍型油菜莫利CMS不育株，花粉活力3%；B為甘藍型油菜莫利CMS株系CGZ 924可育株，花粉活力93%；C為甘藍型油菜莫利CMS F1代植株，花粉活力49%。圖2 莫利CMS在甘藍型油菜中三系配套Fig.2 Three lines of Mori CMS in Brassica napus L.

分別以株系CGZ 924、CGZ 925作為父本與株系CGZ 909進行雜交，獲得的F1代單株花粉活力約50%，套袋自交結實正常(圖2)。表明實現(xiàn)了莫利 CMS在甘藍型油菜中的三系配套，且在甘藍型油菜中莫利 CMS仍表現(xiàn)為配子體不育的特點。

2.2 甘藍型油菜莫利CMS分子標記輔助選擇

Gaikwad等[12]、Kumar等[13]的研究表明，在芥菜型油菜中莫利CMS不育的形成與orf108-atpA共轉錄相關。于是本研究根據(jù)orf108-atpA基因序列設計了3對引物(orf 108-O、orf 108-N、orf 108-B)，來對甘藍型油菜莫利CMS材料進行篩選。

隨機選取甘藍型油菜莫利CMS株系CGZ 909、CGZ 924、CGZ 925材料各2株；甘藍型油菜常規(guī)材料10株(每5株等量混合，共2個混樣)、甘藍型油菜OguCMS材料10株(每5株等量混合，共2個混樣)、白菜型油菜5株(共1個混樣)、芥菜型油菜5株(共1個混樣)。用3對orf 108引物對其進行特異性篩選，結果發(fā)現(xiàn)引物orf 108-O多態(tài)性較好(圖3 A)。再利用引物orf 108-O對甘藍型油菜莫利CMS及非莫利CMS材料進行進一步篩選(其中株系CGZ 909不育株30株、株系CGZ 924可育株30株、CGZ 925可育株30株、F1代可育株30株，甘藍型油菜常規(guī)材料10株、甘藍型油菜OguCMS材料10株、白菜型油菜5株、芥菜型油菜5株)。結果顯，引物orf 108-O在甘藍型油菜中對莫利CMS與其他系統(tǒng)材料有較好的區(qū)分度(圖3 B顯部分實驗結果)。

注：A為分子標記初篩(1～2為甘藍型油菜莫利CMS不育株；3～6為甘藍型油菜莫利CMS可育株；7～8為甘藍型油菜常規(guī)材料；9～10為甘藍型油菜Ogu CMS材料；11為白菜型油菜；12為芥菜型油菜)，引物：orf 108-N、orf 108-B、orf 108-O；B為分子標記orf 108-O篩選(1～16為甘藍型油菜莫利CMS不育株(S); 17～34為甘藍型油菜莫利CMS可育株(F);35～51為甘藍型油菜莫利CMS不育株與可育株雜交F1代;52～55為甘藍型油菜常規(guī)材料；56～59為甘藍型油菜Ogu CMS材料；60～61為白菜型油菜；62～63為芥菜型油菜)。圖3 甘藍型油菜莫利CMS胞質分子標記檢測Fig.3 Cytoplasmic molecular markers detection of Mori CMS in Brassica napus L.

3 結論與討論

本研究中所引入的莫利CMS系統(tǒng)在芥菜型油菜中表現(xiàn)為配子體不育類型。通過甘藍型油菜與芥菜型油菜莫利CMS的多代回交、自交轉育，發(fā)現(xiàn)莫利CMS系統(tǒng)在甘藍型油菜中也表現(xiàn)為配子體不育的特點。因此，花期肉眼無法分辨出不育單株，轉育過程中需通過單株套袋自交輔以花粉活力鑒定來對育性進行辨別。研究表明，在早期轉育世代中，單純以套袋自交結實情況很難快速選育出不育性穩(wěn)定的株系。對轉育的不同株系進行花粉活力鑒定，發(fā)現(xiàn)同為套袋自交不結實單株，花粉活力越低，其后代徹底不育株出現(xiàn)的概率越高。因此，選擇花粉活力低、套袋自交不結實的株系作為后續(xù)甘藍型油菜莫利 CMS不育系選育的基礎材料；花粉活力高、套袋自交正常結實的株系作為后續(xù)甘藍型油菜莫利 CMS恢復系選育的基礎材料。

目前常見的甘藍型油菜不育系統(tǒng)多為孢子體不育，配子體CMS不育株雖然與配子體不育株有著顯著區(qū)別，但正常胞質可育株材料及其他不育系可育株材料很難在當代花期與甘藍型油菜莫利 CMS系統(tǒng)材料進行區(qū)分。育種實踐中為了防止育種材料的機械混雜，需在花期結束前對甘藍型油菜莫利 CMS材料的細胞質進行輔助鑒定。由于本研究所使用的原始材料為芥菜型油菜莫利 CMS商品雜交種F1代，因此其分離出的不育株和可育株材料均攜帶有導致胞質不育的特有線粒體基因組。參考莫利 CMS在芥菜型油菜中的不育基因研究，根據(jù)orf108-atpA基因序列設計的引物orf 108-O對轉育材料進行篩選，并獲得較好的區(qū)分效果。

本研究中獲得的甘藍型油菜莫利CMS材料CGZ 909、CGZ 924和CGZ 925將作為下一步莫利CMS親本選育工作的基礎材料。