賈慧雨，呂娜，馮志海

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046； 2.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000； 3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450001

亞急性甲狀腺炎(subacute thyroiditis，SAT)是一種最常見的痛性甲狀腺炎，發(fā)病大多與病毒感染有關(guān)，也可發(fā)生于非病毒感染之后[1]。本病高發(fā)人群為30～50歲女性，主要特征為甲狀腺部位疼痛，還可能伴有肌肉疼痛、心動(dòng)過速、發(fā)熱、食欲減退等全身癥狀，病程大多2～4個(gè)月，病情嚴(yán)重者常因疼痛明顯而影響日常工作和休息。目前，西醫(yī)治療SAT主要通過應(yīng)用非甾體類抗感染藥或糖皮質(zhì)激素來控制炎癥，雖起效較快，但易產(chǎn)生不良反應(yīng)，且容易反復(fù)發(fā)作。中醫(yī)藥治療SAT不僅安全性更高，且可降低復(fù)發(fā)率。黃藥子-夏枯草-五味子是仝小林院士提出的治療SAT的靶向藥[2]，療效確切，但其具體作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體性與系統(tǒng)性的特點(diǎn)恰與中醫(yī)傳統(tǒng)文化中的整體觀念、辨證論治的思想相對(duì)應(yīng)，同時(shí)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”的研究模式與多味中藥“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的作用特點(diǎn)相呼應(yīng)[3]。因此，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的作用機(jī)制有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，并采用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證研究結(jié)果的可靠性。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分篩選及靶點(diǎn)收集通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)獲取黃藥子、夏枯草、五味子的化學(xué)成分，以口服利用度(oral availability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為條件進(jìn)行篩選，獲取黃藥子、夏枯草、五味子的有效成分。同時(shí)基于TCMSP獲取黃藥子、夏枯草、五味子有效成分的作用靶點(diǎn)，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(http//www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 SAT疾病靶點(diǎn)及黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的潛在作用靶點(diǎn)的獲取在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https：//www.genecards.org/)、DrugBank(https：//go.drugbank.com/)及人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//omim.org/)中以“subacute thyroiditis”為關(guān)鍵詞搜索SAT相關(guān)靶點(diǎn)。運(yùn)用venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線繪制韋恩圖，得到黃藥子-夏枯草-五味子有效成分相關(guān)靶點(diǎn)與SAT相關(guān)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，即為黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選在STRING數(shù)據(jù)庫(https：//www.string-db.org/)中導(dǎo)入黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的潛在靶點(diǎn)，將物種設(shè)置為人(homo sapines)，將置信度得分閾值設(shè)置為high confidence=0.700，隱藏網(wǎng)絡(luò)中的游離節(jié)點(diǎn)，得到潛在靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系。使用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浞治觯鶕?jù)度值(degree)、緊密中心性(closeness centrality，CC)及中介中心性(betweenness centrality，BC)篩選黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 富集分析將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，設(shè)置物種為人類，進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，并以P<0.01為條件進(jìn)行篩選分析，使用微生信在線工具(http：//www.bioinformatics.com.cn/)將富集結(jié)果可視化。

1.5 “關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓?fù)浞治隼肊xcel找出潛在靶點(diǎn)涉及的中藥成分，使用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的“關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證分別選取度值排名前3位的關(guān)鍵靶點(diǎn)和成分作為受體蛋白和配體小分子。在PDB數(shù)據(jù)庫(http：//www1.rcsb.org/)中獲取受體蛋白的晶體結(jié)構(gòu)并下載其pdb格式文件，從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載配體小分子的MOL2結(jié)構(gòu)式，使用AutoDockTools 1.5.6對(duì)配體和受體進(jìn)行分子對(duì)接，并使用Pymol將分子對(duì)接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 黃藥子-夏枯草-五味子的有效成分及靶點(diǎn)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共篩選到黃藥子有效成分15個(gè)，夏枯草有效成分11個(gè)，五味子有效成分8個(gè)，其中包括黃藥子與夏枯草共有成分4個(gè)。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中查找各成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，經(jīng)查詢發(fā)現(xiàn)黃藥子素I、黃藥子素H無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息，將其剔除后共28個(gè)有效成分。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫中將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名，整合重復(fù)靶點(diǎn)后共獲取220個(gè)藥物靶點(diǎn)。見表1。

2.2 SAT疾病靶點(diǎn)及黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的潛在作用靶點(diǎn)以“subacute thyroiditis”為檢索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫中以“≥3.68(score值中位數(shù))”為條件共搜集到768個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)，在OMIM數(shù)據(jù)庫中共搜集到49個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)，在Drugbank數(shù)據(jù)庫中共搜集到44個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)，去重整合后共有826個(gè)SAT相關(guān)靶點(diǎn)。運(yùn)用venny 2.1.0在線繪制韋恩圖，得到黃藥子-夏枯草-五味子有效成分相關(guān)靶點(diǎn)與SAT相關(guān)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)103個(gè)，即為黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的潛在作用靶點(diǎn)。見圖1。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選在STRING數(shù)據(jù)庫輸入103個(gè)潛在靶點(diǎn)，得到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中共有103個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 017條邊，節(jié)點(diǎn)平均degree為19.7，且節(jié)點(diǎn)大小、顏色深淺與degree正相關(guān)。拓?fù)浞治鲲@示，degree中位數(shù)為44，CC中位數(shù)為 0.633 540 37，BC中位數(shù)為 0.002 952 07，篩選出degree、CC、BC均大于中位數(shù)的靶點(diǎn)共42個(gè)，即為黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。見表2，圖2。

表2 黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的前10位關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖2 黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析將103個(gè)潛在靶點(diǎn)輸入Metascape數(shù)據(jù)庫，物種選擇人類，設(shè)置P<0.01，Min Overlap=3，Min Einrichment=1.5。GO富集分析篩選出6 448個(gè)條目，涉及對(duì)無機(jī)物的反應(yīng)(response to inorganic substance)、凋亡信號(hào)途徑(apoptotic signaling pathway)、氧化應(yīng)激(response to oxygen levels)等生物過程(biological processes，BP)5 374個(gè)條目，膜筏(membrane raft)、細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)域(perinuclear region of cytoplasm)、囊腔(vesicle lumen)等細(xì)胞組成(cellular components，CC)407個(gè)條目，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcription factor binding)、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合(protein domain specific binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)等分子功能(molecular functions，MF) 667個(gè)條目。KEGG通路分析共富集出癌癥途徑(pathways in cancer)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號(hào)通路、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路(thyroid hormone signaling pathway)等438條通路，將count值排名前20的通路作為重要通路。見圖3、圖4。

圖3 GO富集分析圖

圖4 KEGG通路富集分析圖

2.5 “關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心成分篩選103個(gè)潛在靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)黃藥子有效成分9個(gè)，夏枯草有效成分8個(gè)，五味子有效成分6個(gè)，含黃藥子和夏枯草共同成分4個(gè)。利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浞治黾翱梢暬＝Y(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中共有143個(gè)節(jié)點(diǎn)、608條邊，其中三角形代表相關(guān)作用通路，菱形代表疾病，橙色圓形代表潛在作用靶點(diǎn)，綠色六邊形代表關(guān)鍵成分，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，degree越大。對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分進(jìn)行拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)有19種關(guān)鍵成分，即為黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的關(guān)鍵成分，其中度值排名前3的分別為槲皮素、木犀草素、山奈酚。見圖5。

圖5 “關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證將p53腫瘤蛋白(tumor protein p53，TP53)、蛋白激酶Bα(protein kinase Bα，AKT1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)作為受體蛋白，槲皮素、木犀草素、山奈酚作為配體小分子，使用AutoDockTools1.5.6對(duì)蛋白進(jìn)行去水、加氫處理，對(duì)小分子進(jìn)行加氫處理。使用AutoDock進(jìn)行分子對(duì)接，并計(jì)算出靶點(diǎn)蛋白與小分子化合物之間的最低結(jié)合能，對(duì)接結(jié)果顯示結(jié)合能全部小于-5 kcal·mol-1，表明受體與配體之間結(jié)合良好，且TP53與木犀草素、AKT1與山奈酚及IL-6與山奈酚的結(jié)合能最低。使用Pymol將分子對(duì)接結(jié)果可視化。見表3，圖6。

表3 分子對(duì)接結(jié)合能

圖6 分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

目前，SAT的發(fā)病機(jī)制不甚清晰，可能和病毒感染所致的自身免疫反應(yīng)有關(guān)[4]，臨床中也發(fā)現(xiàn)SAT患者有時(shí)可有甲狀腺自身抗體滴度的升高。黃藥子-夏枯草-五味子是仝小林院士提出的治療SAT的靶向藥。黃藥子性味苦、寒，有小毒，《本草綱目》描述其具有“涼血、降火、消癭、解毒”之功效，在甲狀腺疾病以及瘡瘍腫毒等病癥的治療中往往頗有成效[5]。臨床研究顯示，在中藥湯劑中加入黃藥子治療SAT可減少發(fā)熱、疼痛，縮短甲狀腺腫大消退時(shí)間，促進(jìn)血沉恢復(fù)[6]。但黃藥子有小毒，具有一定的肝腎毒性，且與給藥劑量、時(shí)間有關(guān)[7]，因此合理、規(guī)范用藥尤為重要?！侗静萁?jīng)疏》記載：“藥子之類，少服，止可外敷?！薄吨兴帉W(xué)》規(guī)定黃藥子用量為 5～15 g，《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》建議不宜超過10 g。臨床中黃藥子煎湯內(nèi)服常用劑量為3～9 g，且不宜長(zhǎng)期服用，以免造成肝腎損害。另外，合理配伍五味子、黃芩、黃柏、當(dāng)歸、甘草等可對(duì)黃藥子起到減毒增效之功[8-9]。夏枯草作為藥物最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》云：“味苦辛、寒。主寒熱、瘰疬、鼠瘺、頭瘡、破癥，散癭結(jié)氣，腳腫濕痹?！毖芯勘砻?，夏枯草顆粒聯(lián)合常規(guī)西藥治療SAT較對(duì)照組改善實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、臨床癥狀更佳，且復(fù)發(fā)率更低[10]。五味子酸甘性溫，肝體陰而用陽，酸甘之味斂陰可養(yǎng)肝體、助肝陽，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，其具有保肝功效，可減輕黃藥子的肝毒性[11]。三藥合用具有清肝瀉火、消癭散結(jié)、斂肝護(hù)肝之效，在臨床治療SAT時(shí)?？扇〉脻M意療效。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選到黃藥子-夏枯草-五味子有效成分28種，提示黃藥子-夏枯草-五味子中多種成分共同發(fā)揮作用治療SAT。其中度值排名前3位的槲皮素、木犀草素、山奈酚均具有抗感染、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等作用[12-18]。研究表明，槲皮素可能通過參與調(diào)控 NF-κB/Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)通路，抑制炎性因子、趨化因子及炎性細(xì)胞介質(zhì)的表達(dá)而發(fā)揮抗感染作用[19]。木犀草素主要以黃酮苷(木犀草苷、葒草素及異葒草素)的形式存在，可顯著抑制IκB激酶β亞基(IκB kinaseβ，IKKβ)和κB抑制因子α亞基(α inhibitor of κB，IκBα)磷酸化，減少細(xì)胞核中p65表達(dá)量，抑制NF-κB信號(hào)通路以發(fā)揮抗感染活性，葒草素還可促進(jìn)核因子E2相關(guān)性因子2 (nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)的表達(dá)和核移位從而發(fā)揮良好的抗氧化作用[20]。山奈酚除抗感染作用外，還可調(diào)節(jié)甲狀腺激素的合成[21]。

本次研究篩選出TP53、AKT1、IL-6、TNF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、半胱天冬酶3(caspase 3，CASP3)等42個(gè)黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，TP53、AKT1通過調(diào)控miRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，參與炎癥反應(yīng)過程[22-24]。IL-6作為經(jīng)典的炎性細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，參與炎癥和免疫反應(yīng)過程[25-26]。TNF抑制劑的應(yīng)用可能誘導(dǎo)SAT的發(fā)生，其機(jī)制可能與細(xì)胞因子失衡有關(guān)[27]。VEGFA可使新生血管形成、增加血管通透性，在許多炎癥性疾病中發(fā)揮作用[28-30]。由此推測(cè)，黃藥子-夏枯草-五味子有效成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)通過發(fā)揮抗感染、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡等作用治療SAT。

GO富集分析結(jié)果表明，黃藥子-夏枯草-五味子可能通過膜筏、囊腔、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域等細(xì)胞成分參與調(diào)節(jié)對(duì)無機(jī)物的反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等生物過程從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白激酶活性等分子功能，發(fā)揮治療SAT的作用。KEGG通路富集分析表明，黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的通路主要包括PI3K/AKT通路、TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路等。研究表明，激活PI3K/AKT通路，上調(diào)PI3K及AKT的磷酸化水平，可促進(jìn)甲狀腺功能恢復(fù)，并抑制炎癥發(fā)生[31]。TNF信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路均為與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及細(xì)胞凋亡相關(guān)的重要通路[32-34]。甲狀腺激素信號(hào)通路與甲狀腺激素水平直接相關(guān)，本研究亦表明TP53、AKT1均在此通路中表達(dá)。由此可推測(cè)，黃藥子-夏枯草-五味子有效成分可通過炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期與甲狀腺激素水平等途徑治療SAT。

分子對(duì)接結(jié)果表明，核心成分與靶點(diǎn)之間具有良好的結(jié)合活性，與TP53結(jié)合最穩(wěn)定的成分為木犀草素，與AKT1、IL-6結(jié)合最穩(wěn)定的成分為山奈酚，預(yù)測(cè)木犀草素和山奈酚在黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了黃藥子-夏枯草-五味子的網(wǎng)絡(luò)模型，篩選出其有效成分，并分析其潛在靶點(diǎn)和相關(guān)通路，探究了黃藥子-夏枯草-五味子主要有效成分及潛在靶點(diǎn)治療SAT的作用機(jī)制，表明黃藥子-夏枯草-五味子治療亞急性甲狀腺炎是多種成分通過多條通路作用于多個(gè)靶點(diǎn)的結(jié)果，分子對(duì)接結(jié)果表明，核心成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合良好，為臨床應(yīng)用黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT提供了思路，為今后的相關(guān)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。但本研究仍有不足之處，如數(shù)據(jù)收集尚不十分全面，由于條件限制尚未進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，后期有待深入研究，以進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果。