張先姝，劉進(jìn)雄，朱 志，唐玖玖，張俊波，印雙紅，3*，張孟琴

(1.銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.銅仁學(xué)院，貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 銅仁 554300；3.銅仁學(xué)院大健康學(xué)院，貴州 銅仁 554300；4.銅仁學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

藤茶學(xué)名為顯齒蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata)，既能入藥又可食用，民間用其嫩莖葉入茶已有數(shù)百年的歷史，據(jù)《中草藥匯編》等文獻(xiàn)記載，藤茶入藥有清熱解毒的功效，可治感冒風(fēng)熱、咽喉腫痛等[1]。藤茶主要含有黃酮類、甾體類、萜類、多酚、多糖類等化學(xué)成分[2]，其中二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DMY)是藤茶的主要活性成分，化學(xué)式為3，5，7，3′，4′，5′-六羥基-2，3-雙氫黃酮醇[3]，能抑制細(xì)菌等微生物的生長[4]，現(xiàn)代研究表明藤茶具有抗氧化、抑菌、提高免疫力、降血脂、清除自由基、抗血栓、抗腫瘤、消炎等作用[5]?，F(xiàn)階段關(guān)于藤茶粉及二氫楊梅素的提取工藝已經(jīng)很成熟，但對(duì)藤茶及其黃酮類成分的生物活性研究基本限于體外試驗(yàn)，對(duì)體內(nèi)的相關(guān)研究較少，而且對(duì)藤茶多途徑、多靶點(diǎn)抗感染作用機(jī)制的研究不夠深入[2]。藤茶的抗氧化活性近年來研究較多，涉及生物醫(yī)藥、食品行業(yè)、畜禽養(yǎng)殖等[6]，但是在水產(chǎn)上的研究應(yīng)用很少。目前，細(xì)菌性疾病是危害魚類養(yǎng)殖的主要生物源疾病[7]。已報(bào)道的細(xì)菌病原微生物有維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcloumnare)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)等。其中維氏氣單胞菌常引起水生動(dòng)物腐皮病、爛尾病、細(xì)菌性敗血癥等多種病癥[8]，嗜水氣單胞菌能夠引起細(xì)菌性敗血癥[9]、急性腸胃炎[10]、皮膚潰爛等疾病[11]，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的損失。在水產(chǎn)細(xì)菌疾病的防治中多采用抗生素進(jìn)行治療，而抗生素的過度使用易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性和水產(chǎn)品殘留等問題[12]，當(dāng)水產(chǎn)細(xì)菌疾病暴發(fā)時(shí)再使用抗生素治療效果也不好，還會(huì)污染水源、危害人們健康。藤茶對(duì)大腸桿菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有抑菌作用[13]，二氫楊梅素對(duì)金黃色葡萄球菌、福氏志賀菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、乙型副傷寒沙門菌和枯草芽孢桿菌均有抑制作用[14]。本試驗(yàn)探究藤茶粉和二氫楊梅素分別對(duì)維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果，旨在證明藤茶粉和二氫楊梅素對(duì)這2種細(xì)菌有抑制作用，為藤茶粉和二氫楊梅素代替抗生素應(yīng)用于水產(chǎn)細(xì)菌病治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

嗜水氣單胞菌(BNCC186123)和維氏氣單胞菌(BNCC138468)均從北京北納創(chuàng)聯(lián)生物有限公司購買。

1.1.2 藥品

二氫楊梅素(含量98%)購自貴州苗藥生物技術(shù)有限公司，藤茶粉購自陜西寶禾生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、瓊脂粉10 g、氯化鈉5 g，溶于1 L蒸餾水中，加熱攪拌溶解后調(diào)節(jié)pH在7.0～7.5之間，121℃滅菌20 min，備用。

液體培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取牛肉膏 5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，溶于1 L蒸餾水中，加熱攪拌溶解后調(diào)節(jié)pH在7.0～7.5之間，121℃滅菌30 min，備用。

1.1.4 主要儀器

高壓蒸汽滅菌鍋、搖床、全自動(dòng)生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

用小砂輪在安瓿管身1/2處劃兩圈，再用75%酒精擦拭管壁消毒，用手掰斷或用鑷子敲斷安瓿管，吸取約0.4 mL液體培養(yǎng)基溶解菌粉，菌懸液則移入指定的液體培養(yǎng)基內(nèi)，并按照37℃、150 r/min培養(yǎng)18～24 h。用移液槍取1 mL菌液于EP管中，以10 000 r/min離心1 min，倒掉上清液，加入1 mL無菌水，混勻，再進(jìn)行10倍稀釋，然后用麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行對(duì)比，得出細(xì)菌的數(shù)量。調(diào)整菌液濃度以1×108cfu/mL作為供試菌液。

1.2.2 藥液的制備

根據(jù)蕭力爭等[15]的研究結(jié)果，茶葉提取物對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度不超過10 mg/mL，二氫楊梅素對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度不超過1.76 mg/mL，稱取1.00 g藤茶粉加入10 mL無菌水，配置成100 mg/mL藥液，再用無菌水以二倍稀釋法配成50、25、12.5、6.25 mg/mL藥液。稱取0.20 g二氫楊梅素，加入10 mL 80%乙醇配置成20 mg/mL藥液，用無菌水以二倍稀釋法配成 10、5、2.5、1.25 mg/mL藥液。

1.2.3 抑菌試驗(yàn)

在超凈臺(tái)上每個(gè)平板中加入20 μL菌懸液，用無菌L型涂布器涂布均勻直到看不見明顯的水滴為止，每種菌設(shè)3個(gè)重復(fù)，用內(nèi)徑為6 mm的無菌打孔器進(jìn)行打孔，每個(gè)平板打6個(gè)孔，在每個(gè)孔中加入10 μL 0.7%瓊脂液(約60℃)進(jìn)行封底[16]，其中5個(gè)孔中依次加入80 μL不同濃度的藥液，剩下的一個(gè)孔加入80 μL溶劑(藤茶粉用無菌水，二氫楊梅素用80%乙醇[4，15])作空白對(duì)照，將加好藥液的培養(yǎng)皿放入37℃全自動(dòng)生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，最后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的大小并記錄。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑≥20 mm為極敏，15 mm≤抑菌圈直徑<20 mm為高敏，10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm為中敏，抑菌圈直徑<10 mm為低敏[17]。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定

將每種指示菌作為1組，每組取7支無菌試管并進(jìn)行編號(hào)，每支試管均加入2 mL液體培養(yǎng)基，用移液槍向1號(hào)試管中加入藥液2 mL，混勻后，吸取2 mL到2號(hào)管中依次類推，最后從5號(hào)試管中吸取2 mL丟棄，6號(hào)加入2 mL培養(yǎng)基作陰性對(duì)照(試管中均加入50 μL菌液)，7號(hào)試管中只加2 mL培養(yǎng)基作空白對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，以上操作每次均更換槍頭。最終配置成表1中的濃度。在搖床中以37℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。觀察菌液生長狀況，菌液澄清時(shí)所對(duì)應(yīng)的藥液為MIC[18]。選取所有清晰無菌生長的試管[19]，取50 μL樣液涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng) 24 h，能殺死99.9% 接種的細(xì)菌(平板上不超過5個(gè)菌落)對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度即為MBC[20]。

表1 藤茶成分濃度

2 結(jié)果與分析

2.1 藤茶粉對(duì)維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果

當(dāng)藤茶粉濃度為100 mg/mL時(shí)，維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的抑菌圈均達(dá)到最大(圖1)，抑菌圈直徑均大于20 mm，屬于極敏藥物。隨著濃度的降低，抑菌圈逐漸減小，當(dāng)濃度為6.25 mg/mL時(shí)，抑菌圈不太明顯(表2)。

表2 藤茶粉對(duì)維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果

注：0為空白對(duì)照，1為100 mg/mL，2為50 mg/mL，3為25 mg/mL，4為12.5 mg/mL，5為6.25 mg/mL。

2.2 二氫楊梅素對(duì)維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果

當(dāng)二氫楊梅素濃度為20 mg/mL時(shí)，維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的抑菌圈均達(dá)到最大(圖2)，抑菌圈直徑均大于15 mm，屬于高敏藥物。隨著濃度的降低，抑菌圈逐漸減小，當(dāng)濃度為1.25 mg/mL時(shí)，抑菌圈不太明顯，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 二氫楊梅素對(duì)維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的抑菌效果

注：0為空白對(duì)照，1為20 mg/mL，2為10 mg/mL，3為5 mg/mL，4為2.5 mg/mL，5為1.25 mg/mL。

2.3 藤茶粉MIC和MBC的測定

藤茶粉MIC和MBC的測定結(jié)果如表4所示，藤茶粉對(duì)維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的MIC和MBC均為6.25 mg/mL，表明藤茶粉具有抗菌活性，對(duì)維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌均有抗菌作用。

表4 藤茶粉MIC和MBC測定

Tab.4 Determination of MIC and MBC of Ampelopsis grossedentata powder

供試菌種Tested strain最小抑菌濃度/(mg/mL) MIC最小殺菌濃度/(mg/mL)MBC維氏氣單胞菌Aeromonas veronii6.256.25嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophi-la6.256.25

2.4 二氫楊梅素MIC和MBC的測定

結(jié)果顯示，二氫楊梅素對(duì)維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的MIC和MBC均為1.25 mg/mL(表5)。結(jié)果表明，二氫楊梅素具有抗菌活性，對(duì)維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌均有抗菌作用。

表5 二氫楊梅素MIC和MBC測定

Tab.5 Determination of MIC and MBC of dihydromyricetin

供試菌種Tested strain最小抑菌濃度/(mg/mL) MIC最小殺菌濃度/(mg/mL)MBC維氏氣單胞菌Aeromonas veronii1.251.25嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophi-la1.251.25

3 討論

3.1 抑菌試驗(yàn)的影響因素

袞秀群[21]的研究表明，藥液濃度的高低與藥物色澤的深淺有直接關(guān)系。由于本試驗(yàn)中配制的藤茶粉藥液顏色較深，可能會(huì)導(dǎo)致在判斷藥液的清澈程度、觀察試管中細(xì)菌生長情況時(shí)結(jié)果不太準(zhǔn)確，但可做含藥培養(yǎng)基來解決藥液顏色干擾的問題。

本研究結(jié)果顯示，藤茶粉和二氫楊梅素對(duì)維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌均有抑制作用，藤茶粉和二氫楊梅素對(duì)以上兩種細(xì)菌的MIC和MBC分別為6.25、1.25 mg/mL；劉勝貴等[22]研究顯示，藤茶不同器官(根、莖、葉)的提取液對(duì)糞球桿菌的MIC分別為7.81、0.98、0.98 mg/mL，對(duì)大腸桿菌的MIC分別為500.00、25.00、7.81 mg/mL，對(duì)陰溝桿菌的最小抑菌濃度分別為31.25、15.68、7.81 mg/mL；蕭力爭等[4]的研究表明二氫楊梅素對(duì)枯草芽孢桿菌和鏈球菌的MIC高于3.52 mg/mL，說明不同的藤茶成分來源對(duì)不同的細(xì)菌抑制效果不同，藤茶粉和二氫楊梅素有廣譜抑菌的作用。鄧新武等[23]研究表明，不同方法提取的藤茶抑菌效果不同；吳海順等[24]研究提到提取溶劑濃度會(huì)影響藤茶活性物質(zhì)的溶解度，進(jìn)而影響其活性成分的功效。由于本試驗(yàn)的藥品是從公司購買的成品，選材、加工提取的不同可能會(huì)導(dǎo)致藥品的有效成分和含量不一，可能會(huì)影響抑菌效果。

3.2 探究藤茶粉和二氫楊梅素治療由氣單胞菌屬引起的魚病

維氏氣單胞菌會(huì)引起宿主腸道、傷口及軟組織感染，導(dǎo)致敗血癥[25]。嗜水氣單胞菌能夠?qū)е滤a(chǎn)動(dòng)物體表、各個(gè)組織臟器呈現(xiàn)出血性炎癥并引起大量死亡[26]。中草藥作為抗菌藥物，其活性成分可直接作用于病原菌，影響或破壞其生長、繁殖和代謝過程，從而達(dá)到殺菌、抗菌的目的[27]。藤茶粉和二氫楊梅素可能是抑制菌體的呼吸代謝、破壞菌體的結(jié)構(gòu)形態(tài)、改變細(xì)胞膜的滲透性[28]，從而發(fā)揮抗菌作用。本試驗(yàn)已得出藤茶粉和二氫楊梅素在體外可以抑制以上兩種細(xì)菌的生長，后期將在魚體內(nèi)進(jìn)行抑菌研究，為中藥藤茶替代抗生素治療魚類細(xì)菌病提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論與展望

本研究選用藤茶粉和二氫楊梅素分別對(duì)維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌進(jìn)行體外試驗(yàn)，結(jié)果顯示，藤茶粉對(duì)維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的MIC和MBC均為6.25 mg/mL；二氫楊梅素對(duì)維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的MIC和MBC均為1.25 mg/mL，表明藤茶粉和二氫楊梅素對(duì)以上兩種細(xì)菌均有一定的抑制作用。

中草藥具有毒副作用小、污染低[29]、不易產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn)，且含有生物堿、苷類、糖類、黃酮、油脂、氨基酸和多種常量及微量元素，這些成分既能補(bǔ)充動(dòng)物營養(yǎng)，又有抗菌和免疫作用，可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫和抗病能力[30]。藤茶是一種中草藥，除了含有黃酮、多糖、多酚和揮發(fā)油外，還含有氨基酸和微量元素等[31]。有研究表明，藤茶中含有17種氨基酸，包括蛋氨酸、谷氨酸等8種人體必須氨基酸[32]。二氫楊梅素可以促進(jìn)鯉魚生長，提高形態(tài)指標(biāo)，防止體內(nèi)脂質(zhì)的過氧化損傷[33]。藤茶粉和二氫楊梅素既能抑菌，又能促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的生長，還能提高機(jī)體免疫力，因此選用適宜的抗菌藥物與中草藥聯(lián)用治療疾病[34]或者作為飼料添加劑應(yīng)用到水產(chǎn)上具有廣闊的前景。