付曉偉，李 麗

（1.天津市薊州區(qū)人民醫(yī)院，天津 301900；2.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300203）

阿戈美拉汀片用于治療成人抑郁癥，2009年2月在歐盟首次獲得批準(zhǔn)，現(xiàn)已在所有歐盟國家及冰島上市。在國內(nèi)，原研廠家法國施維雅于2011年11月獲準(zhǔn)進(jìn)口，2014年12月國內(nèi)廠家江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司獲得仿制藥批準(zhǔn)上市。阿戈美拉汀具有全新的作用機(jī)制，是一種褪黑素激動(dòng)劑，其同人體褪黑素MT1和MT2受體具有很高的親和力。阿戈美拉汀能特異性地增加前額皮質(zhì)去甲腎上腺素和多巴胺的釋放，細(xì)胞外五羥色胺水平未見明顯影響。受體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示，阿戈美拉汀對(duì)單胺再攝無明顯影響，對(duì)α腎上腺素受體、β腎上腺素受體、組胺受體、膽堿能受體、多巴胺受體以及苯二氮類受體無明顯親和力［1-4］。筆者采用HPLC對(duì)阿戈美拉汀片中的4種有關(guān)物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行測定，可有效地檢測其雜質(zhì)（見表1），方法靈敏、準(zhǔn)確。

表1 阿戈美拉汀片有關(guān)物質(zhì)基本信息

1 材料

1.1 儀器 Waters E2695高效液相色譜儀（PDA檢測器），Empower色譜工作站（美國沃特斯公司）；METTLER XSE105十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒公司）；Zorbax Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱（美國安捷倫公司）。

1.2 藥品與試劑 阿戈美拉汀片（法國施維雅藥廠，批號(hào)H20160108、H20160109、H20160110，規(guī)格：25 mg/片）；阿戈美拉汀對(duì)照品（批號(hào)15001，含量為100.1%）；雜質(zhì)Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)16012，純度為99.5%）、雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)16032，純度為99.1%）、雜質(zhì)Ⅲ對(duì)照品（批號(hào)16028，純度為99.4%）、雜質(zhì)Ⅳ對(duì)照品（批號(hào)16024，純度為99.6%）均購自四川省維克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純（天津康科德科技有限公司）；其余試劑均為市售分析純；水為屈臣氏水（純化水）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Waters E2695高效液相色譜儀，Zorbax Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相為0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.0）-乙腈-甲醇（70∶12∶18），流速為1.2 ml/min；檢測波長為230 nm，柱溫：35℃，進(jìn)樣量：10μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 雜質(zhì)對(duì)照品溶液 取雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ約10 mg，分別置于10 ml量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲使溶解，放至室溫，加溶媒至刻度，搖勻，分別作為雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ儲(chǔ)備液。取上述雜質(zhì)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ儲(chǔ)備液，分別用流動(dòng)相稀釋至1μg/ml；取雜質(zhì)Ⅱ儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋至3μg/ml。

2.2.2 供試品溶液 取阿戈美拉汀片研細(xì)粉適量（含阿戈美拉汀1.0 mg），置10 ml量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲10 min使溶解，放至室溫，流動(dòng)相稀釋至刻度，離心，取上清液，制成每1 ml中約含阿戈美拉汀100μg的供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 稱取處方比例混合輔料適量，置10 ml量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲10 min，用流動(dòng)相稀釋至刻度，離心，取上清液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液 分別取阿戈美拉汀及雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各適量，置同一10 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋制成每1 ml中約含阿戈美拉汀100μg，雜質(zhì)Ⅱ3μg，雜質(zhì)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ1μg的混合對(duì)照溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn) 精密量取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液、陰性對(duì)照溶液和系統(tǒng)適用性溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。理論板數(shù)按阿戈美拉汀計(jì)算不低于5 000，阿戈美拉汀峰與雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ峰之間的分離度應(yīng)符合要求，空白和輔料不干擾測定。見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性溶液（A）供試品（B）陰性對(duì)照（C）HPLC色譜圖

2.4 降解試驗(yàn)

2.4.1 酸降解 精密稱取片劑細(xì)粉12.8 mg（約相當(dāng)于阿戈美拉汀1 mg，批號(hào)H20160108），置于量瓶中，加1.0 mol/L鹽酸溶液3 ml，放置4 h，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為中性，加流動(dòng)相，超聲10 min后，取出，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，取該溶液離心，取上清液，精密量取10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.4.2 堿降解 精密稱取片劑細(xì)粉12.8 mg（約相當(dāng)于阿戈美拉汀1 mg，批號(hào)H20160108），置于量瓶中，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液3 ml，放置4 h，加1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為中性，加流動(dòng)相，超聲10 min后，取出，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，取該溶液離心，取上清液，精密量取10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.4.3 氧化降解 精密稱取片劑細(xì)粉12.8 mg（約相當(dāng)于阿戈美拉汀1 mg，批號(hào)H20160108），置于量瓶中，加30%過氧化氫溶液2 ml，搖勻，加流動(dòng)相，超聲10 min后，取出，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，取該溶液離心，取上清液，精密量取10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.4.4 高溫降解 精密稱取樣品細(xì)粉12.8 mg（約相當(dāng)于阿戈美拉汀1 mg，批號(hào)H20160108），置于量瓶中，加流動(dòng)相，超聲10 min后，于90℃水浴中加熱4 h，取出，放冷至室溫，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，取該溶液離心，取上清液，精密量取10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.4.5 光照降解 精密稱取樣品細(xì)粉12.8 mg（約相當(dāng)于阿戈美拉汀1 mg，批號(hào)H20160108），置于量瓶中，加流動(dòng)相，超聲10 min后，于日光下照射1周，取出，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，取該溶液離心，取上清液，精密量取10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

結(jié)果表明，阿戈美拉汀片經(jīng)酸降解、堿降解、氧化降解、高溫降解和光照降解后，各雜質(zhì)峰之間及與主成分峰均能完全分離。同時(shí)有關(guān)物質(zhì)均沒有顯著變化。見圖2。

圖2 酸降解（A）堿降解（B）氧化降解（C）高溫降解（D）光照降解（E）高效液相色譜圖

2.5 線性關(guān)系考查 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下1%雜質(zhì)對(duì)照品溶液適量，用流動(dòng)相逐步稀釋使成梯度濃度，分別精密量取10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)（X），以相對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），分別進(jìn)行線性回歸，并以斜率計(jì)算校正因子，各雜質(zhì)的回歸方程和校正因子見表2。

表2 各雜質(zhì)的回歸方程和校正因子

2.6 定量限與檢測限考查 《中國藥典》中定義，檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。定量限系指試樣中被測物能被定量測定的最低量。常用的方法有直觀法、信噪比法與基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法，本試驗(yàn)采用信噪比法確定定量限與檢測限。精密量取“2.2.1”項(xiàng)下1%雜質(zhì)對(duì)照品溶液適量，采取逐步稀釋法測定，記錄色譜圖。以信噪比（S/N）為10∶1計(jì)算定量限，以信噪比（S/N）為3∶1計(jì)算檢測限。雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅳ的檢測限分別為0.8、3.0、1.0和0.6 ng，相當(dāng)于樣品濃度的0.08%、0.3%、0.1%和0.06%。定量限分別為1.5、6.4、2.3和1.3 ng，相當(dāng)于樣品濃度的0.15%、0.64%、0.23%和0.13%。

2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2.4”項(xiàng)下的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ、雜質(zhì)Ⅲ、雜質(zhì)Ⅳ和阿戈美拉汀峰面積的RSD分別為1.1%、1.7%、0.8%、1.3%和0.5%，表明色譜系統(tǒng)精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下的供試品溶液，分別于室溫條件下放置0、4、6、8、12和24 h后取樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均未檢出，總雜也沒有變化。說明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液共6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均未檢出，表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取片劑細(xì)粉12.8 mg（約相當(dāng)于阿戈美拉汀1 mg）（批號(hào)H20160108），共6份，分別置于10 ml量瓶中，加入雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果雜質(zhì)Ⅰ的平均回收率為100.1%，RSD為0.7%；雜質(zhì)Ⅱ平均回收率為99.8%，RSD為0.5%；雜質(zhì)Ⅲ平均回收率為99.7%，RSD為2.0%；雜質(zhì)Ⅳ平均回收率為99.8%，RSD為1.3%，具體見表3-6。

表3 雜質(zhì)Ⅰ加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表4 雜質(zhì)Ⅱ加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表5 雜質(zhì)Ⅲ加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表6 雜質(zhì)Ⅳ加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.11 有關(guān)物質(zhì)測定 取3批片劑細(xì)粉各適量（約相當(dāng)于阿戈美拉汀1 mg），分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果3批樣品雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均未檢出，其他最大單一雜質(zhì)均小于0.2%，總雜均小于2%。結(jié)果見表7。

表7 有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

3 討論

首先，基于化合物的性質(zhì)和雜質(zhì)譜的情況進(jìn)行了流動(dòng)相的篩選，分別試用了純水體系、乙酸鹽體系、磷酸鹽體系，磷酸鹽體系中各個(gè)雜質(zhì)的峰型是最好的，其他體系中主峰的色譜柱峰型矮胖，同時(shí)拖尾嚴(yán)重。進(jìn)一步優(yōu)化磷酸鹽體系，分別選擇磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，優(yōu)選磷酸氫二鈉，同時(shí)對(duì)于pH和有機(jī)相的種類進(jìn)行了優(yōu)化，磷酸體系中使用磷酸氫二鈉的量最少，有利于色譜柱的長期使用，最終確定流動(dòng)相為0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液（pH=5.0）-乙腈-甲醇。其次，色譜柱對(duì)于分離是十分重要的，不同的色譜柱分離效果差異顯著，作者基于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常規(guī)的C18色譜柱進(jìn)行篩選，對(duì)Zorbax Eclipse Plus C18、Zorbax Eclipse Plus XDB C18、Zorbax SB C18、Zorbax Extend C18和Zorbax TC C18進(jìn)行了比較，其中Zorbax Eclipse Plus C18對(duì)于雜質(zhì)Ⅱ與阿戈美拉汀的分離度是最好的，同時(shí)保證出峰時(shí)間合適，峰型的對(duì)稱性好，主峰的峰純度符合要求，優(yōu)選Zorbax Eclipse Plus C18為最終的色譜柱。最后，在流動(dòng)相體系與色譜柱確定的基礎(chǔ)上，對(duì)于其他色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，比如流速、柱溫等進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，色譜柱的溫度對(duì)于分離是有影響的，溫度越低，分離度越好，當(dāng)溫度低于30℃時(shí)分離度變差，本文分別考查了45、40、35、30和25℃，優(yōu)選35℃；流速對(duì)于分離度的影響比較小，沒有過多的進(jìn)行優(yōu)化。

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，建立的高效液相色譜法可用于本品有關(guān)物質(zhì)檢查。自研片與國外片有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行比較，雜質(zhì)譜基本一致。自研片在無外包裝、影響因素試驗(yàn)條件下放置5、10和30 d，有關(guān)物質(zhì)無顯著變化；在鋁塑包裝外套復(fù)合膜袋包裝，加速試驗(yàn)、長期穩(wěn)定性試驗(yàn)條件下放置6個(gè)月，有關(guān)物質(zhì)無顯著變化。根據(jù)多批次的樣品測定結(jié)果（見表7），最大單雜均小于0.1%，總雜均小于0.1%。因此，暫定單一雜質(zhì)應(yīng)小于0.2%；總雜質(zhì)應(yīng)小于1.0%。

綜上所述，采用作者建立的HPLC法進(jìn)行阿戈美拉汀片的有關(guān)物質(zhì)的控制，該方法快速、準(zhǔn)確，同時(shí)經(jīng)過了全面的方法學(xué)驗(yàn)證，均符合相關(guān)要求。