劉慧清， 張 鵬， 陳河操， 張春亞， 郭旭虹， 王 杰

（ 華東理工大學(xué)化工學(xué)院，大型工業(yè)反應(yīng)器工程教育部工程研究中心，化學(xué)工程聯(lián)合國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

水凝膠得益于其優(yōu)異的生物相容性、傷口適應(yīng)性以及潛在的自愈合及抗菌性能，近年來在組織黏合劑、骨骼及眼修復(fù)、藥物緩釋等諸多前沿領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注[1-6]。盡管水凝膠組織黏合劑與傳統(tǒng)固定材料（如縫合線、骨釘）相比，具有治療創(chuàng)傷小、操作簡單且避免二次創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn)，但是冗長的合成路徑、嚴(yán)苛的儲(chǔ)存條件限制了其在臨床上的大量應(yīng)用[7]。

受限于富含體液的使用環(huán)境，目前組織黏合劑主要通過模仿海洋貽貝絲足的黏附機(jī)理來實(shí)現(xiàn)耐濕黏附性能[8-9]。研究表明，貽貝絲足中富含鄰苯二酚的蛋白質(zhì)和Fe3+等無機(jī)離子，F(xiàn)e3+與多巴的氧化配位雙重交聯(lián)作用是貽貝能夠?qū)崿F(xiàn)水下黏附的重要原因[10]。由此，以殼聚糖、透明質(zhì)酸、海藻酸、纖維素等天然高分子為主鏈，經(jīng)由酰胺化、席夫堿等反應(yīng)制備鄰苯二酚改性的高分子凝膠前體，最后使用高碘酸鈉（NaIO4）、生物酶（如辣根過氧化物酶/雙氧水，HRP/H2O2）、Fe3+等作為交聯(lián)劑制備組織黏合劑已經(jīng)成為開發(fā)新型黏合劑的關(guān)鍵途徑[11-14]。然而，NaIO4的潛在生物毒性、生物酶嚴(yán)苛的儲(chǔ)存條件，以及此類路徑中涉及的復(fù)雜反應(yīng)、提純過程均阻礙著仿生組織黏合劑的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，實(shí)現(xiàn)組織黏合劑的快速簡便制備具有極為重要的開發(fā)價(jià)值。

Xu等[3]和Yang等[5]分別通過羧甲基殼聚糖與海藻酸鈉二醛、聚甲醛葡聚糖大分子之間的席夫堿反應(yīng)，無需交聯(lián)劑便實(shí)現(xiàn)了水凝膠載體的原位制備，該水凝膠生物相容性優(yōu)異，被成功用作眼部藥物治療的緩釋材料。此外，組織黏合劑的便捷制備也取得進(jìn)展。Nghi等[15]報(bào)道了利用羧甲基殼聚糖與醛基透明質(zhì)酸大分子之間的席夫堿反應(yīng)，一步原位制備抗炎組織黏合劑。盡管上述研究的合成路徑便捷，然而鄰苯二酚基團(tuán)的缺失，使得上述水凝膠的耐濕黏附強(qiáng)度與力學(xué)性能仍有不足。

如上所述，受貽貝足絲蛋白的啟發(fā)，學(xué)者們相繼開發(fā)了一系列具有耐濕黏附能力的組織黏合劑，簡化黏合劑的合成路徑，實(shí)現(xiàn)仿生黏合劑的快速制備正逐步成為新的研究熱點(diǎn)。本文以生物相容性、抗菌性、生物可降解性優(yōu)異的天然堿性氨基多糖?殼聚糖（CS）作為高分子骨架[16-17]，分別以3,4-二羥基苯甲醛（DBA）和Fe3+作為黏附基團(tuán)和交聯(lián)劑，采用一步原位法快速制備含鄰苯二酚基團(tuán)的耐濕組織黏合劑；同時(shí)，以傳統(tǒng)的席夫堿-還原反應(yīng)路徑將鄰苯二酚基團(tuán)接枝到殼聚糖主鏈上得到膠前體[2]，然后配制水凝膠。隨后，探究了殼聚糖、鄰苯二酚含量以及Fe3+濃度對(duì)上述兩種方法制備凝膠過程及性能的影響；分析比較了兩種方法所得黏合劑的性能差異；最后，考察了一步原位法所制備的黏合劑材料的表面適應(yīng)性及穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

CS：生物試劑，中黏度，脫乙酰度90%，南通飛宇生物科技有限公司；DBA：生物試劑，純度98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸（HCl）：純度36%～38%，上海泰坦科技股份有限公司；冰醋酸：純度99.5%，上海麥克林生化科技有限公司；硼氫化鈉（NaBH4）：純度98%，上海泰坦科技股份有限公司；六水三氯化鐵：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇：分析純，上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

采用SHIMADZU UV-2550型紫外-分光光度計(jì)（日本島津公司）表征反應(yīng)情況與測定接枝率，波長范圍250～500 nm；采用Anton-Paar MCR 501型流變儀（奧地利安東帕公司）進(jìn)行流變學(xué)分析：平臺(tái)直徑25 mm, 樣品間距0.5 mm；采用HY-0580型萬能拉伸機(jī)（上海衡翼公司）定量測試黏合劑的黏合強(qiáng)度：拉伸速率5 mm/min。

1.3 鄰苯二酚-殼聚糖凝膠的制備

1.3.1 一步原位法 一步原位法通過CS上氨基與DBA上醛基之間的席夫堿反應(yīng)（圖1（a）），同時(shí)經(jīng)由Fe3+與DBA上羥基之間的氧化配位雙重交聯(lián)作用[10]，僅通過簡單的機(jī)械混合（無需任何提純）便可快速制備凝膠。

首先將適量的殼聚糖溶解于一定濃度Fe3+溶液中待用，緊接著配制一定濃度的DBA的乙酸溶液，最后將兩溶液均一混合，可立即制備得到不同原料配比的棕黑色凝膠，整個(gè)制備過程僅需幾分鐘。本文以CS-DBA-Fe-x-y-z的形式命名樣品，即根據(jù)CS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%），DBA的濃度（mol/L）與Fe3+的濃度（mmol/L）來命名所得凝膠。例如，CS-DBA-Fe-1.5-0.2-15，表示溶有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%殼聚糖的15 mmol/L Fe3+溶液，與0.2 mol/L的DBA溶液來原位制備凝膠。文中將CS與DBA混合溶液簡稱為CS-DBA。

1.3.2 席夫堿-還原法 傳統(tǒng)的席夫堿-還原法的反應(yīng)過程如圖1（b）所示。稱取0.2000 g CS完全溶解于40 mL乙酸溶液（φ=1%，pH≈5）后，分別稱取0.1715 、0.5147、0.8579 、1.2010 g DBA完全溶于10 mL乙醇溶液中（CS與DBA的物質(zhì)的量之比為1∶1、1∶3、1∶5、1∶7）。在劇烈攪拌下，將完全溶解于乙醇中的DBA溶液逐滴加入CS溶液中，溶液于45 ℃下避光避氧反應(yīng)24 h。隨后，在反應(yīng)液中分多次加入過量NaBH4，產(chǎn)生大量白色氣泡，體系由黃褐色均一溶液逐漸變渾濁，同時(shí)有灰白色沉淀析出，還原時(shí)間2 h。抽濾后保留濾餅，所得濾餅置于去離子水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值直至產(chǎn)物完全溶解得澄清溶液。產(chǎn)物溶液分別在φ=1%的醋酸與去離子水中透析6 h，再冷凍干燥，所得產(chǎn)物（以下簡稱為CCS）冷藏保存[1]。

圖1 CS-DBA（a）與CCS（b）的合成路線圖Fig. 1 Synthesis process of CS-DBA (a) and CCS (b)

完成膠前體的制備后，分別配制一定濃度CCS水凝膠的Fe3+溶液，以小瓶傾倒法測定樣品的凝膠時(shí)間。類似地，凝膠以CCS-Fe-x-y的形式進(jìn)行命名，即根據(jù)CCS溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)與Fe3+的濃度(mmol/L)來命名。例如，CCS-Fe-1.5-248表示以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的CCS溶液與248 mmol/L的Fe3+溶液進(jìn)行混合來制備相應(yīng)的水凝膠。

1.4 產(chǎn)物的紫外光譜表征

采用紫外-可見光分光光度計(jì)表征CS與DBA的反應(yīng)情況，利用DBA的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線測定CCS的接枝率。

分別配制10、8、5、3.3、2.5、2 μg/mL的DBA的乙酸溶液，以紫外-可見光分光光度計(jì)測得上述各溶液在281 nm處的吸光度，利用origin軟件線性擬合得到DBA溶液質(zhì)量濃度與吸光度之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后將所得產(chǎn)物CCS溶解于50 mL、φ=1%的乙酸溶液中，得到其在281 nm處的吸光度，最后利用測定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其接枝率。

1.5 黏合劑的溶脹率測試

首先采用一步原位法制備CS-DBA-Fe水凝膠，并在既定時(shí)間內(nèi)固化，經(jīng)冷凍干燥后，記錄其質(zhì)量，記為m0。隨后，將水凝膠浸沒在φ=1%的乙酸溶液中，一定時(shí)間后取出溶脹的凝膠，用濾紙小心去除表面殘余的溶液，記錄其質(zhì)量，并記為mt。水凝膠溶脹率（S）的計(jì)算公式為S=（mt?m0）/m0，記錄水凝膠溶脹率隨時(shí)間的變化情況。

1.6 黏合劑的黏合強(qiáng)度測試

將尺寸為25 mm×25 mm脫水處理后的豬皮固定在鋁板上，分別在兩塊豬皮上均勻涂覆300 μL CSFe3+（溶解在鐵離子溶液里的殼聚糖）溶液以及150 μL DBA溶液，將兩塊豬皮搭接在一起后用夾子小心固定，最后在37 ℃下固化2 h。以萬能拉伸機(jī)來測定黏合劑的黏附性能，拉伸速率為5 mm/min，黏合強(qiáng)度的計(jì)算公式為σ=F/(a×b)，其中σ為黏合強(qiáng)度(MPa)，F(xiàn)為測試中最大拉伸作用力（N），a和b分別為黏合區(qū)域的長和寬（mm）。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜表征

圖2示出了CS-DBA和CCS溶液的紫外光譜圖，DBA溶液的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線以及不同取代度CCS產(chǎn)物溶液的紫外光譜如圖2（a）所示，CS溶液在250～500 nm范圍內(nèi)無吸收峰，DBA溶液在281 nm和310 nm處具有鄰苯二酚以及醛基的特征峰，產(chǎn)物CS-DBA溶液則在281nm和343 nm處擁有兩個(gè)特征峰，分別歸屬于鄰苯二酚及席夫堿產(chǎn)物的C＝N鍵[12,18]。圖2（b）中，席夫堿-還原法所制得的CCS膠前體溶液，在281 nm處也出現(xiàn)了鄰苯二酚中苯環(huán)的特征峰，這表明兩種方法均成功將黏性成分DBA接枝到殼聚糖的大分子鏈上。

圖2 CS-DBA溶液（a）、CCS溶液（b）的紫外光譜圖；DBA溶液紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線（c）；不同接枝率CCS溶液的紫外光譜（d）Fig. 2 UV-Vis spectra of CS-DBA (a) and CCS (b) solution; UV-Vis standard curve of the DBA solution (c); UV-Vis spectra of the CCS solution with different graft yield (d)

CCS膠前體的接枝率如表1所示。由表可得，DBA占比逐漸增加時(shí)，CCS膠前體中DBA的接枝率逐漸增加，但是反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率逐漸減小。換言之，反應(yīng)物DBA過量后，參與反應(yīng)的DBA絕對(duì)數(shù)量提升，但是若考慮參加反應(yīng)的DBA質(zhì)量與總DBA質(zhì)量的比值，則反應(yīng)轉(zhuǎn)化率是降低的，這主要是由于DBA接枝后帶來的空間位阻效應(yīng)所導(dǎo)致的[12]。下文中若無特殊說明，均使用nCS∶nDBA=1∶5時(shí)所得的CCS膠前體（接枝率13.37%）開展實(shí)驗(yàn)。

表1 nCS∶nDBA對(duì)CCS膠前體接枝率的影響Table 1 Effect of nCS : nDBA on the graft yield of CCS precursor

2.2 紅外光譜表征

圖3示出了CS、CS-DBA、CCS的紅外光譜圖。如圖3所示，CS中3350 cm?1處為O?H與N?H的伸縮振動(dòng)峰，2870 cm?1處為C?H伸縮振動(dòng)峰，1645 cm?1處歸屬于CS酰胺I區(qū)的伸縮振動(dòng)峰（乙?；腃＝O雙鍵伸縮振動(dòng)峰）[19-20]，1590 cm?1處歸屬于CS酰胺II區(qū)的振動(dòng)吸收峰（N?H的彎曲振動(dòng)峰與C?N的伸縮振動(dòng)峰）[21]，1070 cm?1與1020 cm?1處則是CS中C?O典型的伸縮振動(dòng)峰[2]。與之相比，CCS與CSDBA的紅外光譜圖中，兩者1590 cm?1處酰胺II區(qū)的振動(dòng)吸收峰均得到加強(qiáng)，這是兩產(chǎn)物中分別產(chǎn)生的C?N、C＝N吸收峰與酰胺II區(qū)的振動(dòng)吸收峰疊加的結(jié)果，并且兩者在1500 cm?1處均出現(xiàn)歸屬于鄰苯二酚的伸縮振動(dòng)峰[2]。上述結(jié)果說明，DBA成功接枝到CS的大分子骨架上。

圖3 CS、CS-DBA、CCS的紅外光譜圖Fig. 3 FT-IR spectra of CS, CS-DBA and CCS

2.3 成膠時(shí)間的測定

圖4示出了CCS聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、Fe3+濃度對(duì)CCS-Fe黏合劑成膠時(shí)間的影響，以及CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)、DBA濃度、Fe3+濃度對(duì)CS-DBA-Fe黏合劑成膠時(shí)間的影響。如圖4(a)、4(c)、4(d)所示，當(dāng)兩體系中CCS、CS聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、DBA濃度增大時(shí)，成膠時(shí)間均逐步下降。這主要是由于聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)或DBA濃度增大時(shí)，單位溶液體積內(nèi)參與交聯(lián)的氨基或鄰苯二酚基團(tuán)數(shù)量增加，成膠速率加快，使得成膠時(shí)間下降。不過，采用一步原位法制備的黏合劑在聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)便可實(shí)現(xiàn)水凝膠的制備，在2%時(shí)成膠時(shí)間已基本穩(wěn)定，相比傳統(tǒng)席夫堿-還原法路徑的制備條件更加溫和。另外有所不同的是，如圖4(b)、4(e)所示，成膠時(shí)間不總是隨Fe3+濃度的增大而下降，這主要是由于Fe3+的氧化配位雙重交聯(lián)作用所導(dǎo)致的。當(dāng)Fe3+濃度較低時(shí)，其傾向于與鄰苯二酚基團(tuán)進(jìn)行交聯(lián)速度更快的多配位作用；當(dāng)Fe3+濃度較高時(shí)，它則傾向于與鄰苯二酚進(jìn)行單配位（交聯(lián)速度更快的二配位、三配位作用降低，且單配位對(duì)交聯(lián)程度無促進(jìn)作用），從而降低交聯(lián)速度，導(dǎo)致成膠時(shí)間的上升[10]。

圖4 CCS聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（a）、Fe3+濃度（b）對(duì)CCS-Fe黏合劑成膠時(shí)間的影響；CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)（c）、DBA濃度（d）、Fe3+濃度（e）對(duì)CS-DBA-Fe黏合劑成膠時(shí)間的影響Fig. 4 Influence of CCS polymer mass fraction (a) and Fe3+ concentration (b) on the gelation time of CCS-Fe adhesive; Influence of CS mass fraction (c), DBA concentration (d) and Fe3+ concentration (e) on the gelation time of CS-DBA-Fe adhesive

2.4 黏合劑的流變學(xué)分析

圖5示出了Fe3+雙重交聯(lián)水凝膠CS-DBA-Fe體系的流變性能，以及其與NaIQ4共價(jià)交聯(lián)水凝膠的流變性能比較。如圖5（a）所示，當(dāng)水凝膠CS-DBAFe中CS、DBA的含量增加時(shí)，所得水凝膠將擁有更高的儲(chǔ)能模量G'，這表明單位體積內(nèi)數(shù)量更多的成膠基團(tuán)將對(duì)水凝膠的交聯(lián)程度有利，與成膠時(shí)間測定的結(jié)果相符。如圖5（b）所示，F(xiàn)e3+濃度逐步增加時(shí)其氧化性質(zhì)逐漸增強(qiáng)，所得水凝膠的黏彈性也隨之增強(qiáng)（更接近于共價(jià)交聯(lián)水凝膠）。需要指出的是，NaIO4誘導(dǎo)的共價(jià)交聯(lián)水凝膠（圖5（b））表現(xiàn)出典型的彈性體特征（即G'>G''，且兩者隨頻率變化的波動(dòng)較?。22-23]。然而，一步原位法制備的CS-DBA-Fe水凝膠展示出獨(dú)特的流變性質(zhì)，既不是單純的氧化交聯(lián)體系也不是純粹的配位交聯(lián)體系，而是氧化-配位共存的雙重交聯(lián)體系[10,22-23]。

圖5 CS-DBA-Fe水凝膠(a)和NaIO4共價(jià)交聯(lián)水凝膠(b)的流變性能Fig. 5 Rheological properties of CS-DBA-Fe hydrogel (a) and NaIO4 covalently cross-linked hydrogels (b)

2.5 黏合劑的溶脹度測定

溶脹是水凝膠最基本的性質(zhì)之一，溶脹度可以反映水凝膠與溶液的相互作用情況以及水凝膠內(nèi)部的交聯(lián)程度[24]。因此，本文以溶脹度的測定來反映由Fe3+氧化配位雙重交聯(lián)作用所制得的水凝膠的穩(wěn)定性。如圖6所示，成膠時(shí)間分別為0.5、2 h和24 h的水凝膠在0～2 h的溶脹初期迅速吸水，溶脹度迅速增加。待約4 h后，三者的溶脹度趨于穩(wěn)定，這主要是由于水凝膠內(nèi)部的吸水-失水速率達(dá)到平衡。需要指出的是，以上三者水凝膠均可在水中穩(wěn)定存在85 h以上，其中僅有CS-DBA-Fe-2-0.25-10（0.5 h）水凝膠出現(xiàn)少量失重，但主體仍保持完整。結(jié)果表明，配位作用的存在并未顯著降低水凝膠的穩(wěn)定性，一步原位法所制備的樣品成膠速度優(yōu)異，且性質(zhì)穩(wěn)定。

圖6 CS-DBA-Fe黏合劑的溶脹度測試Fig. 6 Swelling ratio test of CS-DBA-Fe adhesive

2.6 黏合強(qiáng)度的測定

首先，初步考察了一步原位法所得CS-DBA-Fe黏合劑對(duì)不同材料表面的適應(yīng)性。如圖7(a)所示，僅需少量CS-DBA-Fe黏合劑便可牢固黏連60 g塑料、100 g玻璃、120 g金屬以及80 g陶瓷等材料，極大地拓展了其潛在應(yīng)用場景。這主要源于黏合劑表面富含的鄰苯二酚基團(tuán)與各基板表面存在較強(qiáng)的氫鍵作用、疏水作用、靜電作用以及配位等作用。此外，鄰苯二酚還可與組織表面蛋白中的氨基形成強(qiáng)作用，使其成為組織黏合劑開發(fā)所需的關(guān)鍵成分。如圖7(b)所示，相較于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的CCS溶液，CCS-Fe-3-248水凝膠的黏合強(qiáng)度由8.1 kPa顯著增加至29.8 kPa，這說明Fe3+的氧化配位作用顯著增加了黏合劑的力學(xué)強(qiáng)度。相比之下，一步原位法所制備的CS-DBA-Fe-3-0.25-25黏合劑擁有更高的黏合強(qiáng)度（達(dá)到48.8 kPa）。CCS膠前體制備時(shí)，以鹽酸中和過量NaBH4還原劑，可能導(dǎo)致殼聚糖的部分降解，使其分子量下降[25]，另外高濃度膠前體數(shù)小時(shí)的溶解時(shí)長也可能導(dǎo)致其部分氧化，從而造成其黏合性能不佳。最后，進(jìn)一步增加CS-DBA-Fe-3-0.1-10中的DBA、Fe3+濃度，黏合強(qiáng)度從43.0 kPa略微增加至48.8 kPa，這主要是由于CS-DBA-Fe-3-0.1-10中的各組分濃度條件已可實(shí)現(xiàn)水凝膠的充分交聯(lián)，因而黏合強(qiáng)度增加不大，與成膠時(shí)間、流變性質(zhì)中的測定結(jié)果基本一致。

圖7 CS-DBA-Fe黏合劑的材料表面適應(yīng)性（a）；CS-DBA-Fe與CCS-Fe的黏合強(qiáng)度（b）Fig. 7 Material surface adaptability of CS-DBA-Fe adhesive (a); Adhesion strength between CS-DBA -Fe and CCS-Fe (b)

3 結(jié) 論

（1）較傳統(tǒng)的席夫堿-還原法，一步原位法可將CS-DBA-Fe黏合劑的制備時(shí)長大幅縮短至幾分鐘，且可通過改變原料配比實(shí)現(xiàn)對(duì)水凝膠各項(xiàng)性能指標(biāo)的調(diào)控。

（2）Fe3+的氧化配位雙重交聯(lián)水凝膠穩(wěn)定性較好，其在水溶液中保持主體完整可達(dá)85 h以上。

（3）鄰苯二酚基團(tuán)的引入，賦予CS-DBA-Fe黏合劑優(yōu)異的黏合性能及材料表面適應(yīng)性。CS-DBA-Fe與CCS-Fe的最高黏合強(qiáng)度分別為48.8 kPa和29.8 kPa，均優(yōu)于商用纖維蛋白膠的5 kPa[26-27]。