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乙酰哈巴苷通過Wnt信號通路誘導結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡

2022-07-07 09:25蔡曉明
關鍵詞:乙酰細胞周期結(jié)腸癌

周 興,尹 倩,黃 蓉,簡 兵,蔡曉明

川北醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院創(chuàng)新實驗室,南充 637100

結(jié)腸癌(colon cancer)是世界第四大致命癌癥,屬于常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1,2],遺傳、肥胖、缺乏鍛煉和吸煙等是患結(jié)腸癌的危險因素[3]。目前臨床上主要依靠手術治療結(jié)腸癌,由于結(jié)腸癌在早期不易發(fā)現(xiàn),被確診時已錯過最佳手術時機,此時患者往往需要放化療來改善預后[4,5]。但傳統(tǒng)化療藥物不良反應多,而天然藥物的不良反應少,且更為廉價[6]。

筋骨草(AjugaciliataBunge.)是多年生唇形科草本植物,主要分布于中國河北、山東、陜西、甘肅、四川等地。筋骨草全草皆可入藥,在中國民間廣泛被用于治療肺熱咯血、跌打損傷、扁桃腺炎、咽喉炎等疾病,而筋骨草中乙酰哈巴苷(8-O-acetylharpagide,8-OA)的含量最高。根據(jù)You等[7]前期研究顯示,乙酰哈巴苷具有強大的抗炎作用,可以減輕毛細血管早期的炎性滲出,由于炎癥介質(zhì)本身可以在腫瘤進展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,因此乙酰哈巴苷可能通過炎癥途徑發(fā)揮抗腫瘤作用,此外,Konoshima等[8]則發(fā)現(xiàn)乙酰哈巴苷對一氧化氮誘發(fā)的小鼠皮膚癌有明顯的抑制作用,并可抑制N-亞硝基二乙胺和苯巴比妥誘發(fā)的肝癌細胞增殖,表明乙酰哈巴苷可能是一種潛在的抗腫瘤藥物。

本研究旨在通過乙酰哈巴苷作用于結(jié)腸癌HCT116細胞后的一系列生物學行為改變來探討乙酰哈巴苷在抗腫瘤方面所發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及藥物

人結(jié)腸癌細胞株HCT116購自中國科學院上海細胞庫,培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37 ℃,5% CO2和95%濕度。乙酰哈巴苷(成都曼思特生物技術有限公司,純度≥97%,貨號:6926-14-3),溶解于無菌PBS中配置成濃度為2.5 mol/L的儲存液。

1.1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國HyClone公司);胎牛血清(美國Gibco公司);培養(yǎng)瓶、96孔板(美國Corning公司);CCK8(上海東仁化學科技有限公司);細胞凋亡試劑盒(中國碧云天公司);Total RNA Extractor(上海生工生物公司);cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司);SYBR Green PCR Master Mix(北京索萊寶公司);引物合成(上海生工生物公司);XAV939(中國MCE公司);兔抗人IgG一抗、羊抗兔IgG二抗(中國ProteTech公司)。

1.1.3 儀器設備

3111 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司);SW-0J-1FD 超凈工作臺(中國安泰空氣技術有限公司);AE 2000 倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司);BCD-272WDGD-20 ℃冷凍冰箱(中國海爾公司);EasyCyte6-2L流式細胞儀(美國Guava公司);CFX connect熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司);5804R高速低溫離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司);LUX5187139全波長酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);Chemidoc XRS+凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCK8

收集HCT116細胞,離心計數(shù)后調(diào)整密度為1×105個/mL,每孔100 μL鋪入96孔板,待細胞貼壁,實驗組分7組,每組含乙酰哈巴苷的濃度分別為0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mmol/L,對照組加入與實驗組等體積的PBS溶液,全程避光加樣,完成后放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h;第二天每孔加入10 μL CCK8試劑,用酶標儀測定OD450值,計算抑制率。

1.2.2 平板克隆形成實驗

在6孔板中每孔加入HCT116細胞500個,每組3個復孔。實驗組以0.5 mmol/L乙酰哈巴苷處理,對照組加入與實驗組等體積的PBS溶液,在作用HCT116細胞7天后,吸掉培養(yǎng)基,PBS洗滌細胞3次,4%多聚甲醛固定細胞5 min,再用PBS洗滌細胞3次。500 μL結(jié)晶紫染色細胞20 min,PBS洗滌后拍照記錄。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡

將細胞計數(shù)后調(diào)整密度為1×105個/mL,每孔2 mL鋪入6孔板,實驗孔藥物濃度為(0.25、0.5、0.75 mmol/L),對照組加入與實驗組等體積的PBS溶液,培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液,PBS洗滌細胞一次,加入胰酶消化2 min,加入之前收集的細胞培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),1 000 r/min離心5 min,棄上清,用PBS重懸并計數(shù),周期實驗加入1 mL冰浴70%乙醇,混勻后4 ℃固定24 h,1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入1 mL PBS離心后棄上清,每管加0.5 mL碘化丙啶染料37 ℃避光孵育30 min;凋亡實驗取5×104個細胞,1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞,再加入5 μL AnnexinV-FITC染色液,混勻,加入10 μL碘化丙啶染色液,混勻,室溫避光孵育10 min,置于冰上,立即用流式細胞儀檢測。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序

將細胞計數(shù)后調(diào)整密度為1×105個/mL,每孔2 mL鋪入6孔板中培養(yǎng),實驗組(B1、B2、B3)加入乙酰哈巴苷的終濃度為0.5 mmol/L,對照組(A1、A2、A3)加入與實驗組等體積的PBS溶液,培養(yǎng)48 h后收集細胞,用Trizol法提取總RNA,以Illumina HiseqTM測序平臺進行測序分析。

1.2.5 乙酰哈巴苷對HCT116細胞mRNA表達的影響

將細胞計數(shù)后調(diào)整密度為1×105個/mL,每孔2 mL鋪入6孔板中培養(yǎng),細胞貼壁后棄原培養(yǎng)基,實驗組加入乙酰哈巴苷的終濃度分別為0.25、0.5 mmol/L,對照組加入與實驗組等體積的PBS溶液,培養(yǎng)48 h后收集細胞,用Trizol法提取總RNA,取1 μg總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄反應,合成cDNA,反應體系為20 μL。先將RNA模板和Random primer加在一起,補充RNase-free ddH2O至12 μL,進行熱變性(條件:65 ℃,5 min,冰上1 min),再加入其他組分,在漩渦混合器上充分混勻,4 000 r/min,15 s離心;放入PCR擴增儀中,設置反應程序:25 ℃ 5 min,42 ℃ 60 min,70 ℃ 5 min,冰上1 min進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,模板稀釋20倍后進行PCR擴增;體系:SYBR Mixture 12.5 μL,F(xiàn)-primer 1 μL,R-primer 1 μL,cDNA 5 μL,DDH2O 5.5 μL;PCR儀器設置為:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s,共進行40個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 乙酰哈巴苷對HCT116細胞蛋白表達的影響

培養(yǎng)細胞方法和分組同“1.2.5”,48 h后收集細胞加入RIPA裂解液提取總蛋白。配置SDS-PAGE凝膠,100 V電泳2 h左右,直至Marker清晰分離開即可終止電泳,80 V轉(zhuǎn)膜1.5 h后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉封閉液中,常溫封閉4 h,用TBST洗3次。在4 ℃冰箱中搖動孵育一抗過夜,用TBST在室溫下洗膜3次,室溫下振搖孵育二抗1 h,用TBST洗3次,用Bio-Rad凝膠成像儀顯影。

1.2.7 統(tǒng)計學處理

流式數(shù)據(jù)采用FlowJo 7.6分析,Western blot采用Image J對條帶光密度進行定量,所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析處理,采用單因素方差分析,計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 乙酰哈巴苷對結(jié)腸癌細胞增殖情況的影響

CCK8法檢測結(jié)果顯示,結(jié)腸癌HCT116細胞的抑制率隨乙酰哈巴苷濃度的升高而顯著增加(P<0.05),乙酰哈巴苷濃度分別為0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mmol/L時,作用HCT116細胞24 h后的抑制率如圖1所示,分別為(2.22±0.82)%、(8.24±0.90)%、(31.18±6.48)%、(37.12±4.79)%、(52.71±1.96)%、(60.76±3.79)%、(68.65±3.22)%。結(jié)果表明乙酰哈巴苷可呈濃度-時間依賴性地抑制結(jié)腸癌細胞體外增殖。作用24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.91、0.39、0.39 mmol/L,由于48 h至72 h其IC50值相同,表明乙酰哈巴苷主要在最初的48 h內(nèi)發(fā)揮作用,因此后續(xù)取48 h為最佳作用時間。

圖1 乙酰哈巴苷以時間依賴的方式抑制HCT116細胞活性

2.2 乙酰哈巴苷對結(jié)腸癌細胞克隆形成的影響

用0.5 mmol/L乙酰哈巴苷作用HCT116細胞7天后,對照組細胞形成了明顯的克隆(197±16),而藥物處理組的克隆率明顯減少(0.33±0.57)。由圖2所示,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明乙酰哈巴苷能顯著降低HCT116細胞的分裂能力,干擾細胞的克隆形成。

圖2 乙酰哈巴苷顯著抑制HCT116細胞增殖

2.3 乙酰哈巴苷對結(jié)腸癌細胞周期和凋亡的影響

通過流式細胞儀對染色細胞進行分群,從而判斷細胞所處的周期相和凋亡相。結(jié)果如圖3所示,隨著乙酰哈巴苷濃度的逐漸增加,G0/G1期細胞比例由(59.40±0.98)%增加到(85.75±0.84)%,細胞周期被阻滯在G1期。

圖3 乙酰哈巴苷以劑量依賴的方式抑制HCT116細胞周期

細胞凋亡實驗結(jié)果如圖4,顯示0.75 mmol/L乙酰哈巴苷處理HCT116細胞48 h后,早期凋亡細胞從(1.21±0.38)%增加到(17.84±0.41)%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明乙酰哈巴苷可以誘導HCT116細胞發(fā)生凋亡反應。

圖4 乙酰哈巴苷對HCT116細胞凋亡的影響

2.4 轉(zhuǎn)錄組測序篩選乙酰哈巴苷作用HCT116細胞的靶向信號通路

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果數(shù)據(jù)采用DESeq進行分析,結(jié)果如圖5所示,對照組與藥物治療組相比存在4 129個差異基因,其中下調(diào)基因2 208個,上調(diào)基因1 921個。

圖5 轉(zhuǎn)錄組測序火山圖

通過KEGG數(shù)據(jù)庫功能富集,結(jié)果如圖6,發(fā)現(xiàn)Wnt通路是有顯著差異的通路,表明Wnt通路可能是乙酰哈巴苷的靶向信號通路。

圖6 KEGG通路富集結(jié)果

顯著富集功能蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果如圖7,顯示乙酰哈巴苷影響的主要差異蛋白分子有PLK1、KIF11、CDC20、WNT16、NOTHCH3、BUB1、NOXA1、MAPK15等,這些分子的功能主要是參與調(diào)節(jié)細胞周期、有絲分裂、DNA氧化應激損傷應答和細胞代謝等。

圖7 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡

2.5 乙酰哈巴苷對HCT116細胞Wnt信號通路基因mRNA表達的影響

為驗證乙酰哈巴苷對HCT116細胞Wnt信號通路的影響,對Wnt信號通路相關基因進行檢測,實驗結(jié)果如圖8。與對照組相比,乙酰哈巴苷組(0.25、0.5 mmol/L)顯著降低了HCT116細胞β-catenin、c-Myc mRNA的表達(P<0.05)。與細胞周期、凋亡相關基因CyclinD1、Survivin、Bcl-2顯著降低,Bax mRNA顯著上調(diào)(P<0.05),以上結(jié)果表明乙酰哈巴苷在一定程度上抑制了Wnt通路的轉(zhuǎn)錄活性,同時上調(diào)了促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄并下調(diào)了凋亡抑制基因的轉(zhuǎn)錄。

圖8 乙酰哈巴苷對HCT116細胞中Wnt信號通路及細胞凋亡相關基因mRNA水平的影響

2.6 乙酰哈巴苷對HCT116細胞Wnt通路蛋白的影響

為驗證乙酰哈巴苷對HCT116細胞Wnt信號通路蛋白的影響,用乙酰哈巴苷作用HCT116細胞,檢測結(jié)果如圖9,顯示乙酰哈巴苷引起Wnt信號通路及細胞周期相關蛋白β-catenin、c-Myc、Survivin、CyclinD1、Bcl-2、pro-caspase3顯著下調(diào)(P<0.05),乙酰哈巴苷引起細胞凋亡相關蛋白APC、Bax、cleaved-caspase3顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖9 乙酰哈巴苷處理后Wnt信號通路相關蛋白的表達

同時,用XAV939和乙酰哈巴苷各自單獨用藥后對HCT116細胞進行檢測發(fā)現(xiàn)都能顯著降低β-catenin和c-Myc蛋白的表達,二者聯(lián)合用藥后如圖10所示,能進一步降低β-catenin和c-Myc蛋白的表達并降低了HCT116細胞的存活率,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),這些結(jié)果從蛋白水平上表明乙酰哈巴苷抑制了Wnt通路的活性,同時激活了凋亡通路。乙酰哈巴苷與XAV939具有協(xié)同作用,能進一步抑制HCT116細胞的Wnt/β-catenin信號通路。

圖10 乙酰哈巴苷聯(lián)合XAV939處理對β-catenin、c-Mcy表達的影響

3 討論與結(jié)論

結(jié)腸癌約占全世界每年癌癥相關死亡人數(shù)的10%[9]。目前結(jié)腸癌的治療主要以手術為主,化療和放療為輔,對于晚期化療患者來說,化療的有效率低且副作用明顯,生存期只有18個月左右[10]。近年來,在天然植物中尋找能抗腫瘤藥物是一大研究熱點,因為一些傳統(tǒng)的化療藥物,包括紫杉醇和長春新堿[11]均來源于自然植物。

抗增殖是開發(fā)抗癌藥物的重要切入點,CCK8法顯示了乙酰哈巴苷對HCT116細胞的抑制作用呈濃度-時間依賴性,三個時間點的IC50分別為0.91、0.39、0.39 mmol/L,說明乙酰哈巴苷主要在最初的48 h內(nèi)發(fā)揮作用。此外,通過平板克隆形成實驗證明了乙酰哈巴苷可導致HCT116細胞的克隆形成能力明顯減弱。

腫瘤細胞的增殖和生存能力遠強于正常細胞[12],大多數(shù)抗癌藥物能通過誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡來抑制腫瘤細胞增殖[13]。細胞在死亡過程常發(fā)生活性氧水平升高、半胱天冬氨酸蛋白酶激活和染色質(zhì)凝聚等現(xiàn)象[14],其中線粒體跨膜電位丟失誘導細胞色素c從線粒體釋放到胞質(zhì)是誘導凋亡的關鍵步驟[15],而Bax和Bcl2對細胞色素c的釋放和下游caspase蛋白的激活至關重要[16]。對此我們通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),乙酰哈巴苷可以劑量依賴性地影響結(jié)腸癌HCT116細胞的細胞周期,引起細胞周期阻滯于G1期,同時導致細胞的凋亡率明顯升高。

研究證實Wnt信號通路與結(jié)腸癌發(fā)展高度相關[17],其中,β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt經(jīng)典通路的關鍵分子,E-鈣黏蛋白/β-連環(huán)蛋白復合物有助于細胞間粘附穩(wěn)定,從而減少細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。在腫瘤細胞中,β-catenin可激活與癌細胞增殖、周期、凋亡、遷移、侵襲和耐藥性相關的基因轉(zhuǎn)錄,從而導致腫瘤的惡性增殖[19]。此外,β-catenin已被證明是一種有前途的癌癥預防和治療靶點,許多天然產(chǎn)物可作為β-catenin信號傳導的抑制劑,其機制主要是通過磷酸化、泛素化和抑制其核移位實現(xiàn)的,并且天然產(chǎn)物抑制劑在體內(nèi)外的各種腫瘤模型中顯示出了較好的預防和治療效果[20]。β-catenin在細胞核中可促進下游分子Myc的表達,Myc屬原癌基因家族,在核內(nèi)編碼細胞必需的核轉(zhuǎn)錄因子,主要參與調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、分化、周期、代謝、凋亡等[21]。在哺乳動物中,Myc家族蛋白質(zhì)包含c-Myc、n-Myc和l-Myc三類,c-Myc與基因組不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生有關。在靜止細胞中,c-Myc的表達水平較低,一旦細胞進入細胞周期,c-Myc的表達迅速增加數(shù)倍[22]。此外,在約70%的結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)c-Myc蛋白顯著上調(diào),表明c-Myc與結(jié)腸癌的惡性程度呈正相關[23]。

本實驗采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)乙酰哈巴苷共引起HCT116細胞產(chǎn)生4 129個差異基因,其中分別為上調(diào)基因1 921個,下調(diào)基因2 208個,差異基因主要與細胞生長、細胞周期、細胞侵襲、細胞免疫、氧化應激、細胞代謝、分子轉(zhuǎn)運和細胞死亡途徑有關,在差異基因結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫分析后發(fā)現(xiàn),乙酰哈巴苷顯著影響了HCT116細胞的Wnt信號通路,通過乙酰哈巴苷與對照組基因表達和蛋白質(zhì)檢測,證實了β-catenin和c-Myc的顯著下調(diào)。乙酰哈巴苷聯(lián)合Wnt小分子抑制劑XAV939進一步抑制了HCT116結(jié)腸癌細胞的生長,表明Wnt/β-catenin通路還介導了HCT116的耐藥性,抑制Wnt/β-catenin通路可使乙酰哈巴苷的抗腫瘤活性明顯增強。

本研究顯示,乙酰哈巴苷能有效抑制結(jié)腸癌細胞HCT116的增殖活性,基因組檢測發(fā)現(xiàn)細胞的Wnt/β-catenin信號通路發(fā)生顯著差異,推測乙酰哈巴苷可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路使細胞正常的生長受到抑制,進一步誘導細胞凋亡和周期阻滯,從而抑制腫瘤細胞生長。然而,該推測需要佐證,其具體作用途徑尚需進一步深入研究。

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