張炎 李睿 李利軍

摘 要：利用C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）的巰基化適配體修飾金殼磁性顆粒制備了磁性捕獲基底Fe3O4@PEI@Au@Aptamer-SH;以拉曼報(bào)告分子對(duì)巰基苯甲酸（4-MBA）修飾銀納米粒子，并通過(guò)酰胺鍵偶聯(lián)CRP的氨基化適配體，制備了信號(hào)探針Ag@4-MBA@Aptamer-NH2。磁性捕獲基底、抗原CRP以及SERS探針形成三明治夾心復(fù)合物，磁分離富集后，實(shí)現(xiàn)對(duì)CRP的SERS檢測(cè)。在0.1 ng/mL～100 μg/mL濃度范圍，SERS信號(hào)強(qiáng)度（ISERS）與CRP濃度的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。對(duì)人血清樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，回收率為93.1% ～109.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.71%～4.68%（n = 3）。該SERS-磁性生物傳感器具有制備相對(duì)簡(jiǎn)單、線性范圍寬、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，在臨床檢測(cè)診斷方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：C反應(yīng)蛋白（CRP）;適配體;SERS;生物傳感器

中圖分類號(hào)：TP212.3? ? ? ? ? DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2022.03.012

0? ? 引言

Tillet和Francis于1930年在部分急性病患者的血清中發(fā)現(xiàn)C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）。人體血清中CRP是細(xì)菌感染、組織壞死、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的重要標(biāo)志物，是急性炎癥病人血清中可結(jié)合肺炎鏈球菌的莢膜C-多糖蛋白質(zhì)。正常人血清中CRP含量一般不超過(guò)8 μg/mL[1]，在感染細(xì)菌、組織嚴(yán)重壞死、動(dòng)脈粥樣硬化后的6～8 h，CRP的濃度開始升高，在24～48 h達(dá)到高峰，高峰值可達(dá)正常值的數(shù)倍或數(shù)百倍[2]，在消除感染后，其含量急劇下降，一周內(nèi)可恢復(fù)正常。目前，CRP已經(jīng)作為醫(yī)院急診常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目[3]，和血常規(guī)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，是診斷全身細(xì)菌性感染的重要標(biāo)志物[4]。動(dòng)態(tài)觀察CRP有助于在細(xì)菌感染時(shí)合理使用抗生素[5]、對(duì)療效進(jìn)行判斷。

目前，有關(guān)CRP的檢測(cè)方法主要有化學(xué)發(fā)光法[6]、熒光免疫分析法[7-8]、酶聯(lián)免疫分析法[9-10]和電化學(xué)分析法[11]等，這些檢測(cè)方法具有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，已應(yīng)用于臨床診斷和治療，但存在操作繁瑣、耗時(shí)、成本較高等問(wèn)題。

表面增強(qiáng)拉曼光譜法（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）因具有靈敏度高、無(wú)損、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于定性定量分析[12-13]。適配體（Aptamer）作為DNA或RNA單鏈的一小段寡核苷酸序列，與抗體相比，具有穩(wěn)定性好、成本低、容易合成和修飾等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。因此，將SERS技術(shù)和適配體結(jié)合，構(gòu)建SERS適配體生物傳感器受到廣泛關(guān)注[16-17]。如Kim等[18]構(gòu)建了一種CRP的SERS適配體生物傳感器，該傳感器將Au-Te納米粒子固定在銦-錫氧化物底物上，然后將巰基化的CRP適配體修飾到底物上，用于CRP的識(shí)別，將多功能的DNA 3WJ與PAuNPs偶聯(lián)，并結(jié)合SERS信號(hào)放大技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)CRP的檢測(cè)。該策略制備CRP的SERS傳感器在磷酸鹽緩沖液中的檢測(cè)限為2.23 pmol/L，在稀釋的人血清中的檢測(cè)限為3.11 pmol/L。Wu等[8]將固定在磁珠（MBs）上的CRP-Aptamer與AuNPs上的cDNA鏈雜交，形成MB-dsDNA-AuNP夾心結(jié)構(gòu)，當(dāng)加入CRP后，由于CRP與適配體之間的強(qiáng)相互作用，導(dǎo)致AuNPs的釋放，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的SERS檢測(cè)，該方法的檢測(cè)限為2.71 nmol/L。但上述傳感器的制備較為繁瑣，靈敏度不高。

納米Au修飾的磁性粒子對(duì)復(fù)雜生物體系中的目標(biāo)物質(zhì)不僅具有分離富集的作用，而且還能產(chǎn)生更多的“熱點(diǎn)”，進(jìn)一步增強(qiáng)SERS信號(hào)[19]。聚乙烯亞胺（PEI）呈正電性，易吸附到呈負(fù)電性的磁性Fe3O4納米顆粒表面，形成包覆層，帶正電荷的包覆層容易吸附呈負(fù)電性的金納米粒子，可為制備金殼提供金種子位點(diǎn)[20]。本文在磁性Fe3O4納米顆粒表面包覆PEI，以PEI作為中間夾層制備金殼磁性顆粒，再修飾上巰基化的CRP適配體，作為CRP的磁性捕獲基底;在AgNPs表面修飾4-MBA，再通過(guò)酰胺鍵偶聯(lián)氨基化的CRP適配體作為SERS信號(hào)探針，構(gòu)建了CRP的SERS-磁性適配體傳感器。對(duì)磁性捕獲基底、SERS信號(hào)探針?lè)謩e進(jìn)行了表征，并考察了該傳感器的相關(guān)性能。結(jié)果表明，該生物傳感器具有制作相對(duì)簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高、線性范圍寬等特點(diǎn)。

1? ? 實(shí)驗(yàn)部分

1.1? ?儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)試劑分別如表1和表2所示。

1.2? ? ?SERS探針Ag@4-MBA@CRP-Aptamer的制備

AgNPs的制備參考Wang等[21]的方法。將90 mg AgNO3 溶解于500 mL水中，置于裝有回流裝置的三口燒瓶中，加熱至沸騰，保持沸騰15 min，排出O2，快速加入10 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，在沸騰條件下反應(yīng)20 min，關(guān)閉加熱開關(guān)，余溫反應(yīng)1 h后，4 ℃保存。

取1 mL AgNPs，加入100 μL乙醇溶液（含? ? ? ? ? 1 mmol/L 4-MBA），在室溫下混合超聲30 min。分別用去離子水和無(wú)水乙醇洗滌3次，除去未反應(yīng)的4-MBA，得到4-MBA標(biāo)記的AgNPs（Ag@4-MBA），然后將其重新分散到1 mL PBS（pH 7.4）中。加入NHS（10 μL，100 mmol/L）和EDC（5 μL，100 mmol/L）活化4-MBA的羧基末端。隨后將200 μL 10 μg/mL 的氨基化CRP-Aptamer加入溶液中，在室溫下孵育1 h，通過(guò)酰胺鍵偶聯(lián)4-MBA與CRP-Aptamer。最后加入10 μL 50 g/L BSA，室溫超聲反應(yīng)30 min，阻斷其余活性部位。經(jīng)過(guò)洗滌離心后，得到SERS檢測(cè)探針（Ag@4-MBA@CRP-Aptamer），分散于1 mL PBS中，待用。

1.3? ?磁性捕獲基底Fe3O4@PEI@Au@Aptamer-SH的制備

參照Li等[22]提出的溶劑熱合成法：將2.7 g Fe3O4·6H2O溶于80 mL乙二醇溶液中，磁力攪拌30 min使其完全溶解。稱取5.4 g乙酸鈉和2 g PEG 4000加入上述混合溶液中，繼續(xù)攪拌1 h，使其溶劑完全混合均勻。將混合溶液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜內(nèi)（聚四氟乙烯內(nèi)膽），并置于210 ℃鼓風(fēng)干燥箱中反應(yīng)12 h，得到的黑色沉淀用去離子水和乙醇分別清洗3次，置于真空干燥箱內(nèi)60 ℃烘干備用。

將20 mg Fe3O4磁性顆粒溶于10 mL去離子水后，超聲10 min使其完全分散。Fe3O4磁性顆粒溶液與PEI溶液（5 mg/mL）按1∶1的體積比混合后超聲30 min。外加磁場(chǎng)富集分離，用去離子水清洗5次，除去多余的PEI，得到Fe3O4@PEI磁性顆粒，分散保存在5 mL去離子水中，待用。

制備膠體金種子：首先配制200 mL氯金酸溶液（0.25 mmol/L），加入2 mL 1%檸檬酸鈉溶液;在劇烈攪拌下，加入6 mL新鮮配置的硼氫化鈉溶液（0.1 mol/L），繼續(xù)攪拌2 h，獲得膠體金種子溶液，避光保存，備用。將5 mL Fe3O4@PEI磁性顆粒投入到100 mL膠體金溶液中，劇烈超聲反應(yīng)0.5 h。外加磁場(chǎng)富集分離，用去離子水洗滌2次，得到Fe3O4@PEI-Au seed微球，用5 mL去離子水重懸，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將1 mL Fe3O4@PEI@Au seed溶液加入100 mL去離子水中，超聲10 min使其完全分散;向上述溶液中加入200 mg PVP粉末和50 mg鹽酸羥胺，超聲5 min，使加入的固體粉末完全溶解;快速加入150 μL 氯金酸（1%），繼續(xù)超聲反應(yīng)5 min后，外加磁場(chǎng)富集分離，用去離子水清洗3次，除去多余的PVP，得到金殼磁性顆粒Fe3O4@PEI@Au。隨后將200 μL 10 μg/mL的Aptamer-SH加入到溶液中，孵育1 h后，外加磁場(chǎng)富集分離，洗滌去掉沒(méi)有結(jié)合的Aptamer-SH，最后加入10 μL 50 g/L BSA ，室溫超聲反應(yīng)30 min，阻斷其余活性部位。得到磁性捕獲基底Fe3O4@PEI@Au@Aptamer-SH，經(jīng)過(guò)洗滌離心后，再分散于1 mL的PBS中，待用。

1.4? ? 血清樣品及CRP的SERS檢測(cè)

本工作所用血清樣品未經(jīng)任何稀釋。將CRP標(biāo)準(zhǔn)品溶解在PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）中配置100 μg/mL的CRP標(biāo)準(zhǔn)溶液;按需要用PBS溶液稀釋至所需的濃度。將不同濃度的CRP樣液加入1 mL Fe3O4@PEI@Au@Aptamer-SH 捕獲基底中，孵育? 1 h后用PBS清洗3次，洗滌掉未結(jié)合的CRP后，用1 mL PBS重懸;再加入1 mL Ag@4-MBA-@Aptamer-NH2 SERS探針，室溫孵育1.5 h，利用外加磁場(chǎng)分離富集夾心復(fù)合物，用PBS緩沖溶液洗滌3次，除去未結(jié)合的SERS探針后，重懸于1 mL PBS中。然后，取不同濃度的夾心復(fù)合物20 μL滴加到玻片上（玻片置于磁鐵上進(jìn)行磁場(chǎng)組裝），自然晾干后，檢測(cè)拉曼信號(hào)，每個(gè)樣品采集3次拉曼? 光譜。

2? ? 結(jié)果與討論

2.1? ?CRP檢測(cè)原理

CRP檢測(cè)原理如圖1所示。利用CRP-Aptamer對(duì)CRP的特異性結(jié)合能力，磁性捕獲基底Fe3O4@PEI@Au@Aptamer-SH識(shí)別并捕獲樣液中待測(cè)的抗原CRP，加入拉曼信號(hào)探針Ag@4-MBA@CRP-Aptamer后，與磁性捕獲基底上的CRP結(jié)合，形成磁性捕獲基底、目標(biāo)物質(zhì)和SERS信號(hào)探針的夾心結(jié)構(gòu)復(fù)合物，通過(guò)外加磁場(chǎng)分離富集，洗滌去掉游離的SERS信號(hào)探針，進(jìn)行SERS檢測(cè)，SERS信號(hào)強(qiáng)度與一定范圍內(nèi)的CRP濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系。

引入磁性捕獲基底，可方便地捕獲目標(biāo)物質(zhì)，并從復(fù)雜的血清樣液中分離富集目標(biāo)物質(zhì)，避免了復(fù)雜的樣品預(yù)處理。拉曼信號(hào)探針Ag@4-MBA-@-Aptamer-NH2中的納米銀對(duì)4-MBA拉曼信號(hào)具有增強(qiáng)作用，磁性捕獲基底Fe3O4 @PEI@Au@Aptamer-SH中金殼也具有拉曼增強(qiáng)效應(yīng)，因此，納米銀和金殼對(duì)4-MBA拉曼信號(hào)具有協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)，利于提高檢測(cè)靈敏度。

2.2? ? 磁性捕獲基底Fe3O4@PEI@Au的表征

圖2（a）—圖2（d）分別為納米Fe3O4、Fe3O4 @-PEI、Fe3O4@PEI@Au-seed和Fe3O4@PEI@Au的SEM和TEM圖像。由圖2（a）可以看出，納米Fe3O4顆粒具有較好的分散性和均一性;由圖2（b）可明顯觀察到PEI包覆層，親水性的PEI不僅起到保護(hù)層的作用，還可改善磁性顆粒的分散性，避免團(tuán)聚現(xiàn)象;由圖2（c）可以明顯看出，F(xiàn)e3O4@PEI顆粒表面變得粗糙，有小顆粒粘附其表面，說(shuō)明Fe3O4@PEI@Au-seed制備成功;由圖2（d）可看出，粘附在表面的顆粒明顯變大，表明Au種子介導(dǎo)法使還原的Au吸附其表面，證明Au層沉積成功。

圖3（a）表示制備的Fe3O4、Fe3O4@PEI、Fe3O4@PEI@Au-seed、Fe3O4@PEI@Au的磁滯回線，磁化強(qiáng)度分別為81.2 emu/g、 73.1 emu/g、 67.8 emu/g、 52.5 emu/g。由于PEI與AuNPs為非磁性物質(zhì)，所以隨著PEI、AuNPs逐層包覆在磁性顆粒的外圍，導(dǎo)致磁力強(qiáng)度逐漸降低[23]，但基底（Fe3O4@PEI@Au）仍然具有較強(qiáng)的磁性，所制備的磁性基底可采用外加磁場(chǎng)的方法進(jìn)行磁富集分離。

對(duì)制備的材料進(jìn)行XRD表征，結(jié)果如圖3（b）所示。由圖3（b）可知，F(xiàn)e3O4納米粒子分別在2θ為30.2°、35.5°、43.2°、53.6°、57.1°、62.7°處出現(xiàn)衍射峰，分別對(duì)應(yīng)Fe3O4晶型的（220）、（311）、（400）、（422）、（511）、（440）晶面，與粉末衍射文件數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)卡片一致。Fe3O4@PEI中未見有新的衍射峰出現(xiàn)，這是因?yàn)镻EI為有機(jī)聚合物，無(wú)晶型結(jié)構(gòu)。Fe3O4@PEI@Au-seed顯示，在2θ值為38.2°處出現(xiàn)新的衍射峰，對(duì)應(yīng)金的（111）晶面，這與粉末衍射文件數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)卡片一致，說(shuō)明金種子成功地包裹在Fe3O4@PEI的表面。由Fe3O4@PEI@Au可看出，在38.2°處的衍射峰的強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明金種子變大，磁性顆粒包覆了一層金殼。

對(duì)制備的材料進(jìn)行EDS表征，結(jié)果見圖3（c）。Fe3O4@PEI在Fe3O4基礎(chǔ)上出現(xiàn)了N元素，說(shuō)明PEI包覆在Fe3O4顆粒表面;Fe3O4@PEI@Au-seed出現(xiàn)Au元素，表明Fe3O4@PEI表面有Au種子沉積，F(xiàn)e3O4@PEI@Au-seed制備成功;Fe3O4@PEI@Au的Au峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明通過(guò)種子介導(dǎo)的金殼包覆成功。圖3（c）中每個(gè)樣品都出現(xiàn)了Cu元素的峰，由于進(jìn)行TEM檢測(cè)時(shí)，選擇了銅網(wǎng)作為樣品的載體，出現(xiàn)了Cu信號(hào)。在對(duì)樣品進(jìn)行掃描時(shí)，將銅網(wǎng)與樣品視為一個(gè)整體，所以EDS光譜中的Cu信號(hào)來(lái)自于銅網(wǎng)。

2.3? ? SERS探針制備條件的優(yōu)化與表征

2.3.1? ? 4-MBA用量和時(shí)間優(yōu)化

分別將1 mmol/L不同體積（50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL）的4-MBA加入1 mL AgNPs溶液中，在室溫下孵育30 min后，各取20 μL于載玻片上進(jìn)行SERS檢測(cè)。結(jié)果如圖4（a）所示，隨著4-MBA用量的增加，SERS信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，4-MBA用量為200 μL時(shí)SERS信號(hào)強(qiáng)度最大;當(dāng)超過(guò)200 μL時(shí)，SERS強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)。因此，4-MBA的較佳用量為200 μL，用于后續(xù)的試驗(yàn)。為優(yōu)化4-MBA與AgNPs的孵育時(shí)間，將200 μL的1 mmol/L 4-MBA與AgNPs溶液孵育不同的時(shí)間（15 min、30 min、45 min、 60 min、75 min、90 min）后進(jìn)行SERS檢測(cè)，結(jié)果如圖4（b）所示，隨著時(shí)間的不斷推移，在60 min時(shí)，1 598 cm-1 處的SERS信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最高值;超過(guò)60 min后，SERS信號(hào)強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)。因此，確定60 min為最佳反應(yīng)時(shí)間，用于后續(xù)的試驗(yàn)。

2.3.2? ? AgNPs@4-MBA與Aptamer-NH2的用量以及反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

為了優(yōu)化AgNPs@4-MBA與Aptamer-NH2的用量及反應(yīng)時(shí)間，首先將NHS（10 μL，0.1 mol/L）和EDC（5 μL，0.1 mol/L）加入AgNPs@4-MBA溶液中，并在等體積的AgNPs@4-MBA溶液中加入不同體積（50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL）的Aptamer-NH2（10 μg/mL），孵育30 min。AgNPs@4-MBA上的4-MBA的羧酸經(jīng)過(guò)活化后與適配體上的氨基形成酰胺鍵，通過(guò)偶聯(lián)形成SERS探針AgNPs@4-MBA@Aptamer-NH2。如圖5（a）所示，當(dāng)Aptamer-NH2的體積從50 μL增加到200 μL時(shí)，1 598 cm-1處的SERS信號(hào)不斷增強(qiáng);當(dāng)體積超過(guò)200 μL時(shí)，SERS強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)。因此，? ? 200 μL為Aptamer-NH2的最佳用量。SERS信號(hào)強(qiáng)度還與Aptamer-NH2、AgNPs@4-MBA兩者孵育的時(shí)間有關(guān)，為此將200 μL Aptamer-NH2加入同體積的AgNPs@4-MBA溶液混合，反應(yīng)不同的時(shí)間（15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min）后檢測(cè)SERS信號(hào)，結(jié)果如圖 5（b）所示，SERS信號(hào)強(qiáng)度在15～60 min逐漸增強(qiáng)，超過(guò)60 min時(shí)，其強(qiáng)度又逐漸降低。因此，確定最佳反應(yīng)時(shí)間為? ? 60 min。

2.3.3? ? SERS探針的表征

圖6（a）為AgNPs的掃描電鏡和透射電鏡圖像。結(jié)果顯示，制備的AgNPs具有良好的分散性和均一性。圖6（b）分別為AgNPs、Ag@4-MBA、Ag@4-MBA@Aptamer-NH2的紫外可見吸收光譜圖，由圖可知，AgNPs在413 nm處有一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，是AgNPs的等離子共振吸收峰（SPR）;Ag@? ? ? ? ?4-MBA的SPR吸收峰紅移至430 nm處，表明通過(guò)Ag-S鍵4-MBA修飾在AgNPs的表面上;Ag@ 4-MBA@Aptamer-NH2的SPR吸收峰紅移至440 nm，表明適配體成功結(jié)合到AgNPs的表面。

2.4? ?CRP標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量檢測(cè)

CRP標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。圖7（a）標(biāo)出的1 598 cm-1、1 089 cm-1 2個(gè)峰位置是4-MBA的2個(gè)主峰，選擇1 598 cm-1進(jìn)行定量分析是因?yàn)? ? ?4-MBA在1 598 cm-1的拉曼峰強(qiáng)度高于1 089 cm-1處的拉曼峰強(qiáng)度，有利于靈敏度的提高。對(duì)不同濃度的CRP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析檢測(cè)，在0.1 ng/mL ～ 100 μg/mL范圍內(nèi)，隨著CRP濃度的不斷增大，在1 598 cm-1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，SERS信號(hào)強(qiáng)度與濃度的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖7（b）），線性方程為ISERS = 629.06x+650.5，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.954。R2 = 0.954對(duì)于SERS技術(shù)是可以接受的，如文獻(xiàn)[13]設(shè)計(jì)的SERS傳感器，用于CRP定量檢測(cè)，其R2 = 0.891 3;Anh[24]設(shè)計(jì)的SERS傳感器用于CRP的定量分析，R2 = 0.97。比較近幾年CRP的定量檢測(cè)方法，結(jié)果如表3所示。由表3可知，本法具有較強(qiáng)的特異性，同時(shí)線性范圍寬、穩(wěn)定性好、檢測(cè)限低。

2.5? ?SERS-磁性適配體傳感器性能的研究

考察傳感器的選擇性和特異性。分別對(duì)100 μL 10 μg/mL的C反應(yīng)蛋白（CRP）、牛血清白蛋白（BSA）、羧酸酯酶（hCE）、免疫球蛋白G（IgG）、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）以及100 μL PBS溶液進(jìn)行SERS檢測(cè)，結(jié)果如圖8（a）、圖8（b）所示。除CRP以外的干擾物均產(chǎn)生相應(yīng)的SERS信號(hào)，但信號(hào)較弱;目標(biāo)物質(zhì)CRP所產(chǎn)生的SERS信號(hào)最強(qiáng)，遠(yuǎn)大于其他物質(zhì)的信號(hào)，表明傳感器對(duì)CRP具有較好的選擇性和特異性。

考察傳感器檢測(cè)的重復(fù)性和均一性。對(duì)1 μg/mL CRP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，采集同一點(diǎn)的SERS信號(hào)10次，匯總其SERS光譜圖如圖9（a）所示。經(jīng)過(guò)多次對(duì)同一點(diǎn)的激光照射，其1 598 cm-1處的SERS峰強(qiáng)度略微有所下降，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為7.51%（n =10）。對(duì)100 ng/mL CRP的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，采集10次不同點(diǎn)的SERS信號(hào)，匯總其SERS光譜圖如圖9（b）所示，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為6.43%（n =10）。綜上所述，傳感器的SERS信號(hào)具有較好的重復(fù)性和均一性。

該傳感器對(duì)實(shí)際血清樣進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，結(jié)果如圖10所示。由圖10可知，隨著加標(biāo)量的增加，其SERS強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)。加標(biāo)前，檢測(cè)100 μL正常人血清，以1 598 cm-1處拉曼峰強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程計(jì)算出血清中CRP的含量為0.773 ng/mL，這與健康人血清中CRP含量相符[29]。以100 μL不同質(zhì)量濃度CRP（0.773 ng/mL、3.865 ng/mL、77.300 ng/mL）進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。由表4可知，回收率為93.1% ～109.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤ 2.39%（n = 3）。結(jié)果證明傳感器具有較好的準(zhǔn)確性，可用于實(shí)際血清中CRP的檢測(cè)。

考察傳感器的穩(wěn)定性。對(duì)10 μg/mL CRP的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，將制備好的磁性基底和SERS探針置于4 ℃條件下，分別放置1 d、3 d、5 d、7 d、10 d后，進(jìn)行SERS檢測(cè)（n = 3），檢測(cè)結(jié)果如圖11所示。由圖11可知，樣品放置的時(shí)間越長(zhǎng)，SERS信號(hào)強(qiáng)度有逐漸降低的趨勢(shì)，超過(guò)7 d后，SERS強(qiáng)度下降明顯，表明該傳感器穩(wěn)定時(shí)間在7 d以內(nèi)。

3? ? 結(jié)論

本文分別制備了磁性捕獲基底Fe3O4 @P EI@Au@Aptamer-SH和信號(hào)探針Ag@4-MBA @Aptamer-NH2，成功地構(gòu)建了CRP的SERS-磁性適配體傳感器。對(duì)人血清樣進(jìn)行檢測(cè)和加標(biāo)試驗(yàn)，取得了令人滿意的結(jié)果。該傳感器具有制備相對(duì)簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、線性范圍寬、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)改變適配體，該方法也可用于構(gòu)建其他蛋白質(zhì)的SERS傳感器，因此，具有一定的普? ?適性。

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DNA aptamer-based SERS magnetic biosensor for C-reactive protein

ZHANG Yan1，2， LI Rui1，2， LI Lijun*1，2

（1.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources （Guangxi University of Science and

Technology）， Liuzhou 545006， China; 2. School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University

of Science and Technology， Liuzhou 545006， China）

Abstract： A magnetic capture substrate Fe3O4@PEI@Au@Aptamer-SH was prepared by modifying gold-shell magnetic particles with the sulfhydrylated aptamer of C-reactive protein （CRP）; a SERS probe Ag@4-MBA@Aptamer-NH2 was prepared by modifying silver nanoparticles with the Raman reporter molecule p-mercaptobenzoic acid （4-MBA） and coupling the aminated aptamer of CRP by amide bond. The magnetic capture substrate， the antigen CRP and the SERS probe formed a sandwich