郭 俊晏 斌杜冠潮趙 豐鄧楹君王 浩高慶和郭 軍**

1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院（北京 100091）；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)（北京 100029）

良性前列腺增生癥 （benign pr ostatic hyperplasia，BPH）是導(dǎo)致中老年男性出現(xiàn)排尿障礙的最常見的疾病，該病的主要臨床表現(xiàn)包括前列腺體積的增大與下尿路癥狀[1]。該病屬中醫(yī)“精癃”、“癃閉”范疇[2]。BPH的患病率隨著男性年齡的增長而明顯升高?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的藥物治療以α受體阻滯劑和5α還原酶抑制劑為主。中醫(yī)藥治療具有多靶點調(diào)控與個性化診療的特點，在BPH的治療上具有一定優(yōu)勢。其中，黃莪膠囊作為治療BPH的常用上市中成藥，具有益氣活血、清熱利濕的功效，可降低BPH患者IPSS評分，提升生活質(zhì)量，減小前列腺體積，改善最大尿流率[3]。

復(fù)方中藥對于疾病的治療是基于其多成分的特點，從多個靶點與通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將醫(yī)學(xué)、大數(shù)據(jù)科學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科進(jìn)行交叉融合，以反映藥物對于疾病的干預(yù)機(jī)制的方法。本次研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接方法，以探究黃莪膠囊對于BPH的作用機(jī)制，為后續(xù)的研究提供參考。

方 法

一、黃莪膠囊相關(guān)靶點的篩選

應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）分別檢索黃莪膠囊中12味中藥的有效成分。在TCMSP中，ADME（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion）屬性值分別選用藥物口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18作為黃莪膠囊有效成分的統(tǒng)一篩選標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)對于12味中藥的有效成分進(jìn)行補(bǔ)充，并將補(bǔ)充獲取的有效成分在TCMSP中再次檢索，確保有效成分符合統(tǒng)一篩選標(biāo)準(zhǔn)。通過TCMSP檢索并收集黃莪膠囊中12味中藥有效成分所對應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點信息。下載Uniport數(shù)據(jù)庫[4]中已驗證的人類蛋白質(zhì)與基因信息，并將所收集的蛋白質(zhì)靶點信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理為統(tǒng)一的基因名。

二、BPH靶點的獲取

以“benign prostatic hyperplasia”、“benign prostatic hypertrophy”、“BPH”等為關(guān)鍵詞，在GeneCards[5]、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫中搜索并獲得與BPH相關(guān)的靶點。GeneCards數(shù)據(jù)庫中以Relevance score量化靶點與疾病的關(guān)系，若該數(shù)據(jù)庫中靶點信息過多，則以大于Relevance score的中位數(shù)值為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出相關(guān)性更高的靶點。將三大數(shù)據(jù)庫中的靶點信息進(jìn)行合并且去除重復(fù)值，得到與BPH相關(guān)的靶點信息。

三、黃莪膠囊PPI（protein-protein interaction）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

旨在了解黃莪膠囊藥物成分的相關(guān)靶點與BPH靶點的相互作用關(guān)系，故利用R軟件，將上述得到的黃莪膠囊靶點與BPH相關(guān)靶點相映射，取二者交集，得到黃莪膠囊治療BPH的潛在作用靶點并繪制韋恩圖。將潛在作用靶點導(dǎo)入STRING平臺[6]，將蛋白種類設(shè)置為“Homosapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”＞0.9，其余條件均為默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建黃莪膠囊治療BPH的PPI網(wǎng)絡(luò)。

將基于STRING平臺得出的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)出，利用Cytoscape 3.8.2軟件[7]進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的圖形繪制，利用Cytoscape中Analyze Network的功能對于PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)涞贸龅燃壷担╠egree）、緊密中心度（Closeness Centrality）、鄰域連通性（Neighborhood Connectivity）與介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）等，按照degree進(jìn)行排序，并按照degree值的大小設(shè)置節(jié)點大小、顏色；按照蛋白與蛋白互作聯(lián)系的緊密性設(shè)置連線的顏色、粗細(xì)，最終將黃莪膠囊治療BPH的核心靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。

四、富集分析

Metascape平臺是功能強(qiáng)大的基因功能注釋分析工具，該平臺數(shù)據(jù)更新速度快，覆蓋多個權(quán)威數(shù)據(jù)庫，可對基因或蛋白質(zhì)進(jìn)行批量注釋與分析[8]。

將黃莪膠囊治療BPH的核心靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入至Metascape平臺，對其進(jìn)行基因本體（Geneontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，其中GO分析包括BP（biological process）、CC（cellular component）、MF（molecular function）。將數(shù)據(jù)庫與基因集的物種限定為“Homosapiens”，閾值設(shè)置P＜0.01。并將數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入至R軟件中，分別以柱狀圖與氣泡圖的形式呈現(xiàn)。

五、藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建黃莪膠囊成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用內(nèi)置工具Network Analysis功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?，依?jù)連接度（Degree）、介度（Betweenness Centrality）及緊密度（Closenesss Centrality）等判斷核心成分、靶點與通路之間的關(guān)系。

六、分子對接驗證

選擇黃莪膠囊成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖中degree排名前5的靶點，在PDB數(shù)據(jù)庫篩選其PDB ID，并下載靶點的3D結(jié)構(gòu)，運(yùn)用PyMOL軟件對結(jié)構(gòu)進(jìn)行去除水分子、去除磷酸根等操作。再應(yīng)用AutoDockTools 1.5.6及AutoDock Vina軟件[9]對degree排名前3的化合物分子進(jìn)行對接，并計算對接能量。

結(jié) 果

一、黃莪膠囊治療BPH潛在靶點的獲取

通過篩選，黃莪膠囊的12味中藥共獲得85個活性成分；獲取黃莪膠囊作用靶點286個，BPH靶點986個。利用R軟件，將上述黃莪膠囊靶點與BPH靶點進(jìn)行映射，如圖1所示，得到133個黃莪膠囊治療BPH的潛在靶點。

圖1：黃莪膠囊成分-BPH靶點韋恩圖

二、PPI網(wǎng)絡(luò)分析

如圖2所示，黃莪膠囊用于BPH治療中相關(guān)度較高的靶點為腫瘤抑制因子p53、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase1，MAPK1）、腎上腺素能受體α1a（adrenoceptor alpha 1A，ADRα1a）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，pkb1/AKT1）、內(nèi)皮素1（Endothelin-1，ET-1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF)、雄激素受體（androgen receptor，AR）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase 3，NOS3)、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、表 皮 生 長 因 子 受 體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等。其中，相關(guān)度排名前10的靶點見表1。

表1 黃莪膠囊核心靶點靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

圖2 黃莪膠囊干預(yù)BPH的潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

三、GO功能、KEGG通路富集分析及藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

GO分析得到分子功能145個，生物過程2173個，細(xì)胞組分74個。前20條GO分析結(jié)果如圖3所示，主要涉及凋亡信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo) （regulation of apoptotic signaling pathway）、氧化 應(yīng)激 （response to oxidative stress）等過程。

圖3 黃莪膠囊干預(yù)BPH潛在靶點的GO分析結(jié)果

KEGG分析共得到322條具有顯著意義的通路，前20條與BPH相關(guān)度較高的通路如圖4所示，主要包括抗腫瘤、促進(jìn)凋亡、抑制炎癥等。

圖4 黃莪膠囊干預(yù)BPH潛在靶點的KEGG分析結(jié)果

藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)如圖5所示。依據(jù)degree值篩選出排名前3的化合物分子，見表2。

圖5 黃莪膠囊藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

表2 黃莪膠囊主要有效成分靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

四、分子對接預(yù)測黃莪膠囊活性成分與潛在靶點的結(jié)合能力

對黃莪膠囊藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)分析中得出的核心有效成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇與關(guān)鍵靶點p53、MAPK1、ADRα1a、AKT1、ED-1進(jìn)行分子對接。若結(jié)合能＜0 kcal·mol-1，則配體小分子可和受體蛋白自發(fā)結(jié)合，若結(jié)合能＜-5.0 kcal·mol-1，表明其結(jié)合性好，小于-7.0 kcal·mol-1結(jié)合活性較強(qiáng)，結(jié)合能越小對接越好[10]。對接結(jié)果見表3。93.3%的有效成分與靶點蛋白結(jié)合較好，20%的有效成分與靶點蛋白結(jié)合較強(qiáng)，其中β-谷甾醇與MAPK1的結(jié)合最好。利用PyMOL對成分與靶點對接后的分子表面結(jié)構(gòu)與棍狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化呈現(xiàn)，以結(jié)合程度最高的β-谷甾醇與MAPK為例進(jìn)行展示，結(jié)果見圖6、圖7。

表3 黃莪膠囊中有效成分與核心靶點結(jié)合能預(yù)測

圖6 β-谷甾醇與MAPK1結(jié)合的分子表面結(jié)構(gòu)

討 論

中醫(yī)雖無BPH的病名，但在古籍中早有記載，當(dāng)屬于“癃閉”、“精癃”的范疇?！端貑枴ば魑鍤馄吩唬喊螂撞焕麨轳患s為遺溺?！额愖C治裁·閉癃遺溺》曰：閉者小便不通，癃者小便不利。氣虛、瘀血、濕熱為該病的主要致病因素[11]。病變位于腎與膀胱，證屬本虛標(biāo)實，益氣活血，清熱利濕法是BPH的重要治法。

黃莪膠囊以黃芪、桃仁為君藥，黃芪甘溫，為補(bǔ)氣之要藥，既可益氣固表、利尿消腫，亦能助氣行血以化瘀；桃仁入膀胱經(jīng)，功善祛瘀。“氣為血之帥，血為氣之母”，黃芪與桃仁相伍，益氣活血，互增效用。臣藥莪術(shù)、大黃、益母草均有活血散結(jié)之用；土茯苓祛濕熱，亦有入絡(luò)之功；夏枯草乃散結(jié)常用之品，兼有和陽養(yǎng)陰之能。佐藥北豆根可助土茯苓清熱利濕；肉桂溫?zé)嶂约瓤芍螂讱饣造铕?，亦能防全方苦寒太過。使藥牛膝利尿通淋，且能引血下行，使藥可直達(dá)病所。全方共奏益氣、活血、散結(jié)、利濕之用。

一、潛在有效成分分析

本次研究發(fā)現(xiàn)共獲得85個活性成分，作用靶點286個，將最終數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2中，利用Analyze Network計算活性成分的節(jié)點值，發(fā)現(xiàn)黃莪膠囊中degree最高的有效成分包括槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）與蘆薈大黃素（aloe-emodin）等。

槲皮素與山奈酚均為天然黃酮類化合物。其中，槲皮素多從植物中提取，具有多重生物活性，有降低氧化應(yīng)激、抗炎等作用[12]。A.Ghorbanibirgani通過隨機(jī)雙盲試驗，應(yīng)用槲皮素對BPH患者進(jìn)行干預(yù)發(fā)現(xiàn)，槲皮素與安慰劑相比，可明顯降低前列腺癥狀評分，提升尿流率[13]。山奈酚又稱為山萘黃素、山奈素等，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種藥理活性。山奈酚可抑制雙氫睪酮誘導(dǎo)的雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性、PSA和AR基因的表達(dá)以及LNCaP、BPH-1細(xì)胞的增殖，明顯降低BPH大鼠前列腺指數(shù)，改善BPH大鼠的病理性質(zhì)[14]。β-谷甾醇作為植物甾醇的一種，存在于眾多植物的細(xì)胞膜中，有降血脂、抗炎、抗腫瘤的作用[15]。Cosentino V等讓BPH患者連續(xù)3月，每隔3天服用一次含有β-谷甾醇的膳食補(bǔ)充劑，發(fā)現(xiàn)患者IPSS評分降低與尿流量的顯著增加[16]。蘆薈大黃素作為蒽醌類化合物有抗前列腺增生作用，可顯著降低BPH模型小鼠的前列腺系數(shù)[17]。

通過分子對接發(fā)現(xiàn)黃莪膠囊中的核心有效成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、蘆薈大黃素與關(guān)鍵靶點（p53、MAPK1、ADRα1a、AKT1、ED-1）的結(jié)合活性較好，這也反應(yīng)了預(yù)測的可靠性。

二、靶點分析

由于BPH的主要增生部位前列腺基質(zhì)的組成以平滑肌為主，富含大量α1腎上腺素受體（αadrenoceptor，α1-AR）。當(dāng)交感神經(jīng)興奮后，去甲腎上腺素作用于α1-AR致平滑肌收縮，而出現(xiàn)動力性梗阻。黃莪膠囊對α1-AR存在競爭性拮抗作用[18]，以降低尿道平滑肌張力，緩解后尿道壓力以改善排尿癥狀。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在PI3K的激活下參與調(diào)控各種細(xì)胞功能，包括正常和惡性細(xì)胞的增殖、生存、代謝和血管生成[19]。研究發(fā)現(xiàn)AKT基因的過表達(dá)和前列腺體積的增大有關(guān)[20]。ET-1可介導(dǎo)前列腺平滑肌收縮，導(dǎo)致動力性梗阻癥狀的出現(xiàn)；董佳晨通過對空白組、模型組、黃莪膠囊高、低劑量組大鼠前列腺組織中內(nèi)皮素進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)ET-1在黃莪膠囊高、低劑量組中表達(dá)較模型組明顯降低，發(fā)現(xiàn)黃莪膠囊可降低ET-1在BPH組織中的表達(dá)水平[21]，改善尿道出口梗阻的癥狀。

三、生物富集分析

通過GO功能富集分析可知，生物學(xué)進(jìn)程包括凋亡信號通路、氧化應(yīng)激反應(yīng)、蛋白磷酸化正調(diào)控、對生長因子的反應(yīng)等，主要涉及蛋白激酶活性、激酶綁定、轉(zhuǎn)錄因子綁定、信號受體調(diào)節(jié)活性等方面的功能。

依據(jù)KEGG富集分析結(jié)果，并結(jié)合黃莪膠囊的前期實驗研究及目前BPH研究進(jìn)展，筆者認(rèn)為PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、FoxO信號通路可能是黃莪膠囊治療BPH的主要作用通路。

PI3K（Phosphoinositide-3 kinase）屬于磷脂激酶家族，是肌醇及磷脂酰肌醇的主要激酶。AKT（Protein kinase B）是PI3K下游信號通路中最為重要的一個蛋白，它是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶。該信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡[22]。Karli Sreenivasulua通過q-PCR評估27名年齡在55歲至75歲之間的BPH患者前列腺組織中PI3K和AKT的基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)隨著前列腺體積的增加而顯著增加[20]。故預(yù)測PI3K/AKT通路的過表達(dá)會導(dǎo)致BPH中細(xì)胞凋亡減少從而導(dǎo)致前列腺體積的增大。

FoxO信號通路中，F(xiàn)oxO亞家族可促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程和自噬[23]。Dey Strom和Gustafsson指出雌激素受體-β可以通過增加FoxO3a的轉(zhuǎn)錄，通過caspase-9途徑促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡[24]。李琦等觀察到使用苦參堿抑制前列腺癌細(xì)胞增殖后FoxO1a、FoxO3a、FoxO4和FoxO6的表達(dá)顯著增加[25]，表明苦參堿可能通過FoxO信號通路抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。雖然FoxO信號通路在前列腺增生方面的相關(guān)研究較少，但是以上結(jié)果表明FoxO信號通路可能在前列腺細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期中起到重要作用。

白細(xì)胞介素（IL-17）是新型炎癥細(xì)胞因子家族的創(chuàng)始成員。雖然IL-17的促炎特性是其宿主保護(hù)能力的關(guān)鍵，但不受限制的IL-17信號傳導(dǎo)自身免疫性疾病和癌癥進(jìn)展有關(guān)[26]。在IL-17信號通路中，促炎性因子IL-17的表達(dá)升高會刺激IL-6和IL-8的多倍增長，IL-6和IL-8會促進(jìn)BPH基質(zhì)生長[27]。

綜上所述，黃莪膠囊中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、蘆薈大黃素等有效成分可能通過作用于p53、MAPK1、ADRα1a、AKT1、ET-1靶 點，調(diào) 控PI3K-Akt、FoxO、IL-17等信號通路，抑制前列腺細(xì)胞增殖、緩解后尿道壓力而治療BPH。