宣澤義，陳嘉磊，陳少梅，易顯鳳,3，文信旺,3，肖正中,3，汪燕玲，雷初朝*

(1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所,南寧 530001；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.廣西家畜遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001；)

在人類文明演進(jìn)的過程中，牛一直扮演著重要的角色，在古代，牛不僅是食物來源，更是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料。我國幅員遼闊，自然條件復(fù)雜多樣，良好的生態(tài)環(huán)境孕育了極具特色的地方黃牛品種。按照《中國畜禽遺傳資源志——牛志》記載，中國目前擁有53個(gè)地方黃牛品種[1]。按照地理分布和起源差異，中國黃?？梢苑譃楸狈近S牛、中原黃牛和南方黃牛三大類。從牛的起源進(jìn)化來看，北方黃牛主要是普通牛起源，棲息地在黃河流域以北；南方黃牛以瘤牛起源為主，在中國南方大量分布；中原黃牛則屬于普通牛和瘤牛的混合起源，在黃河中下游和淮河流域都有大量分布[2]。

廣西壯族自治區(qū)地處我國南部，氣候溫暖濕潤，降水充沛，高溫持續(xù)時(shí)間較長。在獨(dú)特的氣候條件和勞動(dòng)人民的精心選育下，逐漸形成了優(yōu)良的廣西地方黃牛品種—隆林牛。隆林牛中心產(chǎn)區(qū)在隆林縣境內(nèi)，在西林縣與田林縣也有分布[1]。隆林牛體格中等，體軀結(jié)構(gòu)勻稱，性情溫順，肌肉飽滿，耐粗飼、耐勞，適應(yīng)性好，肉質(zhì)細(xì)嫩、屠宰率較高，是理想的役肉兼用品種[3]。郟縣紅牛是中國八大地方良種之一，主要分布在郟縣、寶豐、魯山等縣，其體型外貌特征明顯，全身被毛多呈紅色，具有肉質(zhì)好、耐粗飼性強(qiáng)和繁殖力高等特點(diǎn)[1]。

線粒體DNA(mtDNA)具有不發(fā)生重組、嚴(yán)格遵循母系遺傳、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)，被廣泛用于追溯家牛的母系起源和分類研究[4-12]。家牛mtDNA具有豐富的遺傳多樣性，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7種顯著分化的mtDNA支系：包括T1-T5及I1和I2支系[6-12]。Lai等[6]對中國西南地區(qū)14個(gè)品種共84頭黃牛的mtDNA D-loop區(qū)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)中國黃牛的母系可分為普通牛和瘤牛兩大支系。Lei等[7]對231頭中國地方黃牛進(jìn)行mtDNA D-loop區(qū)的遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)中國黃牛存在4個(gè)普通牛支系(T1-T4)和兩個(gè)瘤牛支系(I1和I2)。Jia等[8]對亞洲6個(gè)國家的家牛mtDNA D-loop區(qū)序列進(jìn)行分析，在中國黃牛中檢測到亞單倍型組T1A、T3A、T3B和單倍型組T5。Xia等[9]分析了170個(gè)“土雷諾-蒙古?！比后w的線粒體DNA基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)有普通牛T1-T4支系，并伴有瘤牛I支系及P、Q和牦牛支系。對我國肉牛培育品種云嶺牛的mtDNA全基因組分析發(fā)現(xiàn)，共有T1-T4、T6和I1、I2共7種支系，證實(shí)云嶺牛品種具有豐富的線粒體DNA遺傳多樣性[10]。

目前，僅有郟縣紅牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性與母系起源的研究[4]，未見郟縣紅牛mtDNA全基因組序列遺傳多樣性的報(bào)道。盡管Xia等[12]對廣西隆林牛、潿洲牛與南丹牛3個(gè)地方黃牛品種的mtDNA全基因組進(jìn)行了分析，但有關(guān)隆林牛與郟縣紅牛mtDNA全基因組的比較研究未見報(bào)道。因此，本研究對15頭隆林牛和28頭郟縣紅牛的mtDNA全基因組序列進(jìn)行比較分析，以探究隆林牛和郟縣紅牛的遺傳多樣性與母系起源，為隆林牛和郟縣紅牛的種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究使用的15頭隆林黃牛和28頭郟縣紅牛mtDNA全基因數(shù)據(jù)來源于本團(tuán)隊(duì)的黃牛全基因組重測序原始數(shù)據(jù)(表1)和已發(fā)表的文獻(xiàn)[2,11-12]。另外從GenBank下載T1-T5、I1和I2共7個(gè)mtDNA全基因組序列(EU177841，AY676856，EU177839，AB074964，EU177862，EU177868，AF492350)作對照，對共計(jì)50條mtDNA全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)分析。

表1 隆林牛與郟縣紅牛mtDNA基因組的個(gè)體號(hào)與單倍型

1.2 數(shù)據(jù)分析

用TRIMMOMATIC軟件[13]對隆林牛、郟縣紅牛和下載的7個(gè)牛mtDNA全基因組標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，使用BWA-MEM軟件[14]將質(zhì)控后的clean reads映射到普通牛參考基因組(ARS-UCD1.2_Btau5.0.1Y;GCF_002263795.1)的線粒體基因組(GenBank：AY526085.1)上，再將BAM比對轉(zhuǎn)化為FASTQ文件，最后使用Mapping Iterative Assembler v1.0 (MIA,https://github.com/mpieva/mapping-iterative-assembler)組裝mtDNA基因組序列。

使用DnaSP v5.10軟件[15]對所有隆林牛和郟縣紅牛的mtDNA全基因組序列進(jìn)行比對分析，并對單倍型和可變位點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，確定隆林牛和郟縣紅牛的單倍型和單倍型組類型，并整理統(tǒng)計(jì)相關(guān)的遺傳多樣性參數(shù)，如單倍型多樣度(Hd)，核苷酸多樣度(Pi)和平均核苷酸差異數(shù)(K)。利用MEGA 5.0軟件[16]對隆林牛和郟縣紅牛的mtDNA基因組序列進(jìn)行比對分析，并進(jìn)行人工校正，構(gòu)建其mtDNA基因組的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(IQ-Tree)。

2 結(jié)果與分析

2.1 隆林牛和郟縣紅牛mtDNA全基因組遺傳多樣性

使用DnaSPv 5.10軟件對15頭隆林牛和28頭郟縣紅牛構(gòu)成的mtDNA全基因組數(shù)據(jù)集進(jìn)行比對分析，用以評估其mtDNA的遺傳變異情況并追溯母系起源。隆林牛15個(gè)mtDNA全基因組序列，定義10種單倍型，郟縣紅牛28個(gè)mtDNA全基因組序列，定義28種單倍型(表2)。隆林牛和郟縣紅牛43個(gè)mtDNA全基因組序列，共定義36種單倍型，其中郟縣紅牛有26種單倍型；隆林牛僅有8種單倍型，單倍型Hap29和Hap36由2個(gè)黃牛品種共享(表1)。隆林牛和郟縣紅牛mtDNA基因組的遺傳多樣性和支系組成見表2。

從表2可以看出，郟縣紅牛的單倍型多樣度(Hd±SD)為 1.000±0.010，略高于隆林牛(0.943±0.040)，其核苷酸多樣度(Pi±SD)、平均核苷酸變異數(shù)(K)也高于隆林牛，說明這2個(gè)黃牛品種有豐富的mtDNA遺傳多樣性，但郟縣紅牛的遺傳多樣性更高一些。隆林牛和郟縣紅牛43個(gè)mtDNA全基因組序列的平均單倍型多樣度(Hd±SD)為 0.989±0.009，平均核苷酸多樣度(Pi±SD)為0.0074±0.0006。

表2 隆林牛與郟縣紅牛的mtDNA全基因組遺傳多樣性和支系組成

2.2 隆林牛和郟縣紅牛mtDNA全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹

使用iTOL v5工具[17]，將7條 T1-T5和I1-2支系的mtDNA全基因組序列，與15頭隆林牛和28頭郟縣紅牛定義的36種mtDNA全基因組序列單倍型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(IQ-Tree)(圖 1)，發(fā)現(xiàn)隆林牛和郟縣紅牛均有普通牛T支系和瘤牛I支系兩大母系起源(表2)，其中T支系擁有16種單倍型，占44%(16/36)，I支系包含20種單倍型，占55%(20/36)。具體來說，28頭郟縣紅牛mtDNA全基因組定義28種單倍型，含有T2、T3、T4及I1支系，分別占3.6%(1/28)、21.4%(6/28)、21.4%(6/28)和53.6%(15/28)，即：T支系占46.4%，I支系占53.6%，表明普通牛與瘤牛對郟縣紅牛的影響基本一致。15頭隆林牛mtDNA全基因組定義10種單倍型，含有T3、T4和I1支系，分別占10%(1/10)、20%(2/10)和70%(7/10)，即：T支系占30%，I支系占70%，表明瘤牛對隆林牛的影響占主導(dǎo)地位。

3 討 論

家牛mtDNA遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究，目前大多是針對mtDNA D-loop區(qū)進(jìn)行的[4-8]。隆林牛分布于中國南方瘤牛區(qū)，郟縣紅牛則在普通牛和瘤牛血統(tǒng)較為混雜的中原地區(qū)。目前關(guān)于中國黃牛mtDNA全基因組遺傳多樣性的研究不多[9,10,12]。早先對mtDNA D-loop區(qū)的研究，證明中國黃牛有普通牛和瘤牛兩大母系起源[18,19]。前人的研究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代家牛至少有7種mtDNA支系，在非洲分布的主要是T1支系；T2和T3支系主要在近東地區(qū)和歐洲大陸；而T4支系為東北亞地區(qū)所特有[20]；I1和I2單倍型組則常見于印度次大陸和中國南方黃牛群體[21,19]。本研究對15頭隆林牛和28頭郟縣紅牛的mtDNA全基因組序列進(jìn)行聯(lián)合分析，共確定36種單倍型，其中隆林牛有8種特有單倍型，郟縣紅牛有26種特有單倍型。有趣的是，隆林牛和郟縣紅牛的共享單倍型僅有2種，推測這兩個(gè)黃牛品種可能在漫長的時(shí)間尺度上擁有少量共同母系祖先群體。在隆林牛中發(fā)現(xiàn)3個(gè)支系：普通牛T3(10%)和T4(20%)支系，瘤牛I1支系(70%)，說明隆林牛的母系起源以瘤牛為主；在郟縣紅牛中發(fā)現(xiàn)4個(gè)支系：普通牛T2(3.6%)、T3(21.4%)、T4(21.4%)、瘤牛I1(53.6%)支系，表明普通牛與瘤牛對郟縣紅牛的母系影響基本一致，這是郟縣紅牛的顯著特點(diǎn)。上述結(jié)果表明，這2個(gè)地方黃牛品種各自擁有獨(dú)特的母系遺傳信息，表現(xiàn)出明顯的母系遺傳差異。

本研究發(fā)現(xiàn)28頭郟縣紅牛和15頭隆林牛的單倍型多樣度分別是1.000±0.010和0.0943±0.040，其遺傳變異程度均要高于中國地方黃牛的平均水平[18,19,22]，并且郟縣紅牛的遺傳多樣性水平相對更高。推測這可能與其所處的地理位置有關(guān)，郟縣紅牛的主產(chǎn)區(qū)在中國中部，而中原地區(qū)多為普通牛與瘤牛的混合血統(tǒng)，其普通牛與瘤牛的比例基本一致，加上中原開闊的地理位置、良好的生態(tài)環(huán)境等都為牛種的基因交流帶來極大的便利，不同牛種血統(tǒng)的滲入使郟縣紅牛群體擁有豐富的遺傳多樣性；相比之下，隆林牛的母系起源以瘤牛為主，普通牛為輔，這是由于隆林牛主產(chǎn)區(qū)多為南方山區(qū)，潮濕炎熱，寄生蟲很多，而瘤牛恰恰能耐熱抗寄生蟲，故隆林牛以瘤牛為主，更能適應(yīng)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境。隆林牛是廣西地區(qū)重要的地方黃牛遺傳資源，郟縣紅牛是我國中原地區(qū)代表性地方黃牛品種之一。鑒于目前我國政府對畜禽遺傳資源高度重視，要求應(yīng)保盡保。因此，盡管本研究發(fā)現(xiàn)隆林牛和郟縣紅牛mtDNA基因組遺傳多樣性豐富，但近30年來國外商品肉牛大量與我國地方黃牛品種進(jìn)行雜交改良，導(dǎo)致我國地方黃牛品種遺傳資源持續(xù)萎縮和混雜，故對我國地方黃牛品種資源保護(hù)的力度還需進(jìn)一步加大。本研究從母系遺傳角度對隆林牛和郟縣紅牛品種進(jìn)行了系統(tǒng)評估，為其遺傳資源保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù)。