陳嘉磊，夏小婷，肖正中，陳寧博，雷初朝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所,廣西南寧 530001)

中國(guó)黃牛品種資源豐富，是世界牛品種資源庫(kù)的重要組成成分，目前，我國(guó)共有53個(gè)地方黃牛品種和8個(gè)培育品種[1]。關(guān)于中國(guó)家牛的馴化，最早的考古記錄可追溯到距今4 500到4 000年左右，普遍認(rèn)為是通過(guò)文化交流從西亞或中亞進(jìn)入中國(guó)國(guó)內(nèi)[2]。中國(guó)的普通牛群體主要分布在北方地區(qū)，瘤牛群體則在南方地區(qū)廣泛存在，至于中間地帶的家牛則為普通牛和瘤牛的混合血統(tǒng)[3]。

蒙古牛原產(chǎn)于蒙古高原地區(qū)，現(xiàn)廣泛分布于蒙古國(guó)、俄羅斯，中國(guó)內(nèi)蒙古、東北、華北北部和西北地區(qū)，是一個(gè)古老的黃牛品種[4-5]。蒙古高原地處內(nèi)陸，屬于溫帶大陸性氣候，氣候寒冷干燥，冬季漫長(zhǎng)[6]。在極端寒冷的冬季，蒙古牛仍可以在自然放牧且無(wú)補(bǔ)飼條件下正常生長(zhǎng)生存，具有較高的生產(chǎn)性能和遺傳穩(wěn)定性[7]。在漫長(zhǎng)的自然選擇和人工培育下，逐漸形成了抗寒耐病、耐粗飼和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)的蒙古牛品種[8]。

線粒體是細(xì)胞中進(jìn)行生物能量代謝的細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所，能產(chǎn)生細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量[9]。mtDNA有以下特性：(1)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單穩(wěn)定，在世代傳遞中不發(fā)生重組[10]；(2)嚴(yán)格遵循單性母系遺傳方式，因而馴化后仍能保持其野生祖先的mtDNA類(lèi)型，而不受外來(lái)公畜雜交改良的影響[11]；(3)在不同的物種間、種內(nèi)的不同群體間具有廣泛的多態(tài)性，因而能作為可靠的母系遺傳標(biāo)記，用以研究畜種的起源、演化和分類(lèi)。家畜的mtDNA存在于細(xì)胞質(zhì)中的線粒體內(nèi)，是共價(jià)閉合的環(huán)形雙鏈DNA分子[9]。對(duì)牛mtDNA的研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)代家牛的線粒體支系主要是T和I支系，分別屬于普通牛和瘤牛支系[12]。普通牛的線粒體支系主要有T1、T2、T3、T4和T5，單倍型多樣性從馴化地近東地區(qū)向周邊地區(qū)遞減[13-14]；瘤牛的線粒體支系主要有I1和I2，線粒體和考古學(xué)證據(jù)均顯示印度河谷是瘤牛最初的馴化地[14-15]。

目前，就蒙古牛單個(gè)品種而言，mtDNA 全基因組遺傳多樣性、單倍型類(lèi)型及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化研究較少，本研究對(duì)10頭蒙古牛進(jìn)行三代測(cè)序及mtDNA全基因組序列的分析，結(jié)合早先發(fā)表的26頭蒙古牛線粒體數(shù)據(jù)，從母系遺傳角度鑒定蒙古牛的遺傳多樣性，厘清蒙古牛的母系起源，并為其保種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

本研究使用的10頭蒙古牛三代數(shù)據(jù)(NMG02-05,NMG07-10,NMG12,NMG16)來(lái)源于本團(tuán)隊(duì)的蒙古牛全基因組重測(cè)序原始數(shù)據(jù)；另外從GenBank下載26頭蒙古牛線粒體全基因組序列(表1)，并下載T1-T5，I1和I2共7個(gè)mtDNA全基因組單倍型組標(biāo)準(zhǔn)序列(EU177841，AY676856，EU177839，AB074964，EU177862，EU177868，AF492350)作對(duì)照。

表1 蒙古牛36個(gè)mtDNA基因組的個(gè)體號(hào)

1.2 數(shù)據(jù)分析

使用NGMLR軟件[16]將clean reads比對(duì)到普通牛參考基因組(ARS-UCD1.2)上獲得BAM文件，再通過(guò)SAMtools軟件[17]從基因組BAM中提取線粒體基因組。將線粒體基因組的BAM比對(duì)轉(zhuǎn)化為FASTQ文件，再使用Mapping Iterative Assembler v1.0 (MIA,https://github.com/mpieva/mapping-iterative-assembler)組裝mtDNA序列。

使用DnaSP v5.10軟件[18]對(duì)蒙古牛的mtDNA序列進(jìn)行分析，對(duì)蒙古牛的單倍型和可變位點(diǎn)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算單倍型多樣度(Hd)，核苷酸多樣度(Pi)和平均核苷酸差異數(shù)(k)等遺傳多樣性參數(shù)。利用MEGA 5.0軟件[19]對(duì)蒙古牛mtDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，之后進(jìn)行人為校正，構(gòu)建蒙古牛mtDNA單倍型IQ-Tree。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古牛線粒體DNA全基因組的序列特征

對(duì)36頭蒙古牛的線粒體全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),其平均比對(duì)率為99.82%，平均深度為4241.06 ×(18253.70×-190.22×)。堿基組成分析表明，A+T的含量(63.4%)明顯高于G+C的含量(36.6%)。在蒙古牛群體中共檢測(cè)到962個(gè)變異位點(diǎn)，有808個(gè)單一多態(tài)位點(diǎn)，115個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。778個(gè)單一多態(tài)位點(diǎn)為兩堿基突變，28個(gè)為三堿基突變位點(diǎn)；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)中有108兩堿基突變，7個(gè)三堿基突變位點(diǎn)。

2.2 蒙古牛線粒體DNA全基因組遺傳多樣性

使用DnaSPv 5.10 軟件對(duì)蒙古牛的36個(gè)mtDNA全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，36個(gè)mtDNA基因組全序列可定義為22種單倍型，其單倍型多樣度(Hd±SD)為0.997±0.010，核苷酸多樣度(Pi±SD)為0.01281±0.010，平均核苷酸變異數(shù)(K)為87.230，表明蒙古牛有豐富的mtDNA遺傳多樣性。

2.3 蒙古牛線粒體DNA全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

使用iTOL v5工具[20]構(gòu)建蒙古牛的IQ-Tree，將7條已知單倍型組信息的mtDNA基因組序列(包括單倍型 T1-T5和I1-2支系)，與36個(gè)蒙古牛的mtDNA基因組單倍型構(gòu)建IQ-Tree(圖 1)。發(fā)現(xiàn)蒙古牛有普通牛和瘤牛兩個(gè)母系起源，其中32頭屬于普通牛，4頭屬于瘤牛，說(shuō)明蒙古牛群體中，線粒體支系以普通牛為主。IQ-Tree展示了蒙古牛mtDNA基因組的兩個(gè)大單倍型組：普通牛T單倍型組和瘤牛I單倍型組。單倍型組 T3 在蒙古牛中所占頻率最高47.2% (17/36)，其次是T2，頻率為22.2% (8/36)，再次是T4，頻率為19.4% (7/36),最后是I1，頻率均為11.1% (4/36)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)T5和I2單倍型。

3 討 論

早先的研究發(fā)現(xiàn)，普通牛的線粒體支系包括T1-T4等，呈現(xiàn)出較為明顯的地理分布規(guī)律：T3單倍型主要在歐亞地區(qū)，T2支系主要在意大利、巴爾干半島和亞洲地區(qū)，T1在非洲地區(qū)有很高的特異性[12,21]。瘤牛的線粒體支系主要是I，分為I1和I2兩大分支，其主要馴化地在印度次大陸北部[12,15]。本研究所涉及的36頭蒙古牛中，共檢測(cè)到22種單倍型。具有普通牛起源的32個(gè)個(gè)體中有19種單倍型組，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性；而在4頭具有瘤牛起源的個(gè)體中，僅檢測(cè)到3種單倍型組，遺傳多樣性較貧乏。推測(cè)形成這種單倍型分布格局的原因有二：一是普通牛分布地域較廣，在強(qiáng)大的受選擇壓力和外部環(huán)境的作用下，堿基突變的頻率相對(duì)較高；瘤牛分布范圍相對(duì)有限，且氣候環(huán)境較為適宜；二是普通牛的野生祖先單倍型類(lèi)型較多，野牛馴化為家牛后仍保留了較多的單倍型類(lèi)型；而瘤牛間的基因交流可能比較頻繁。此外，大量的歷史和考古記錄指出，瘤牛在公元前兩千年引入中國(guó)新疆，印度瘤牛則在公元二世紀(jì)出現(xiàn)在中國(guó)內(nèi)陸地區(qū)，推測(cè)對(duì)蒙古牛品種的滲入可能發(fā)生在古代中國(guó)“絲綢之路”時(shí)期，貿(mào)易網(wǎng)絡(luò)東起長(zhǎng)安，西至地中海地區(qū)，向南延申到印度，連接起了中國(guó)內(nèi)陸與中東、南亞各國(guó)，大規(guī)模的貿(mào)易往來(lái)與人員遷徙伴隨著瘤牛的流動(dòng)，引發(fā)了中國(guó)內(nèi)陸牛品種的血統(tǒng)交融[22]。

雷初朝等[23]研究了中國(guó)8個(gè)黃牛品種共22個(gè)個(gè)體mtDNA D-loop區(qū)的堿基組成，A+T和G+C的含量分別為61.65%和38.35%。通過(guò)分析10頭蒙古牛的mtDNA全基因組堿基組成，發(fā)現(xiàn)A+T(63.4%) 的含量明顯高于G+C含量(36.6%)，這與其他物種的研究結(jié)果一致，說(shuō)明普通牛群體中，無(wú)論是mtDNA基因組全序列還是D-loop區(qū)，堿基含量都相似，符合脊椎動(dòng)物mtDNA堿基組成的特點(diǎn)，也與哺乳動(dòng)物mtDNA堿基組成基本比例相一致[24,25]。單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)常用作衡量群體mtDNA變異程度的重要參考，其數(shù)值越高，群體遺傳多樣性就越豐富[26]。本研究中36頭蒙古牛的單倍型多樣度為1±0.0045，遺傳變異程度高于黃牛平均水平，反映出蒙古牛有很高的遺傳多樣性，這可能與其所處的地理位置有關(guān)。蒙古牛主要分布在蒙古高原及其毗鄰地區(qū)，牧草豐美、地理開(kāi)闊，為牛種的基因交流帶來(lái)極大的便利，使蒙古牛群體擁有豐富的遺傳多樣性。mtDNA在牛上的研究與應(yīng)用較為廣泛，本研究首次應(yīng)用三代測(cè)序技術(shù)構(gòu)建蒙古牛母系遺傳圖譜，對(duì)厘清蒙古牛群體內(nèi)的血緣關(guān)系和制定培育方案有著積極的育種效用。