劉媛媛 閆芳 章朦玥 姚晨 孫艷玲 文江曼 張怡軒 張雪

(沈陽(yáng)藥科大學(xué)，沈陽(yáng) 110016)

天然產(chǎn)物在藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和藥物發(fā)展過程中扮演著非常重要的角色[1]。與植物相比，微生物因具有來(lái)源廣泛、生長(zhǎng)周期短、能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類型豐富、生物活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物等優(yōu)勢(shì)，已成為天然活性先導(dǎo)化合物的重要資源庫(kù)。然而，對(duì)于普通環(huán)境微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究已經(jīng)有較長(zhǎng)的歷史，從中發(fā)現(xiàn)新骨架和活性較好的先導(dǎo)化合物的幾率在迅速下降[2]。鑒于此，越來(lái)越多的研究者把目光投向了特殊生態(tài)環(huán)境微生物，如極端環(huán)境微生物(高鹽堿度、超高溫、超低溫)、動(dòng)物或者植物體內(nèi)的微生物(即內(nèi)生菌)等[3]。植物內(nèi)生菌是指存活于健康植物組織內(nèi)部，而又不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯的感染癥狀的微生物類群，主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌等[4]。1993年，Stierle等[5]首次從短葉紅豆杉的樹皮中分離出一株能夠產(chǎn)生知名抗腫瘤藥物紫杉醇和其它紫杉烷類化合物的內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae。這一發(fā)現(xiàn)使藥用植物內(nèi)生真菌作為新的藥物資源受到人們的廣泛關(guān)注，內(nèi)生真菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的報(bào)道也越來(lái)越多[6-12]。

莢果蕨(Matteuccia struthiopteris)為球子蕨科莢果蕨屬多年生草本植物，其帶葉柄基的根莖入藥稱為“莢果蕨貫眾”，民間用于預(yù)防流行性感冒、流行性乙型腦炎、流行性腮腺炎等病毒感染性疾病[13-14]。目前尚未見莢果蕨屬植物內(nèi)生真菌的研究報(bào)道。在前期對(duì)采自莢果蕨根莖的內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性篩選中，發(fā)現(xiàn)一株青霉屬真菌Penicilliumsp.SYP-F-7610的液體發(fā)酵產(chǎn)物在100 μg/mL時(shí)對(duì)大腸埃希菌(Escherichia coliCMCC44103)和乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphiB CMCC50094)的抑制率分別為80.1%和87.5%，為此對(duì)該菌株進(jìn)行了大規(guī)模的發(fā)酵和次級(jí)代謝產(chǎn)物研究，從中分離并鑒定了7個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物(圖1)，分別為青霉酸(1)、3,5,6-三甲基-2,4-二羥基苯甲酸甲酯(2)、苔黑酚(3)、4-羥基苯乙酸甲酯(4)、6-hydroxy-5-methoxy-3-methyl-3,6-dihydro-2H-pyran-4-carboxylic acid (5)、chermesinone A (6)和(R)-甲羥戊酸內(nèi)酯(7)。抑菌活性測(cè)試表明，化合物1對(duì)大腸埃希菌(Escherichia coliCMCC44103)、乙型副傷寒沙門菌(SalmonelaparatyphiB CMCC50094)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereusATCC14579)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniaeCMCC46117)表現(xiàn)出抑制作用，IC50值為3.19～6.79 μg/mL。

圖1 化合物1～7的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structures of compounds 1～7

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

Bruker Esquire 2000質(zhì)譜儀(瑞士Bruker公司)；Waters Synapt G2 QTOF質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；Agilent 1260分析型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；EYELA N-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會(huì)社)；Bruker AVANCE-600型超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；Jasco VP-1020全自動(dòng)旋光儀(日本分光株式會(huì)社)；制備型高效液相色譜儀(日本島津公司)；EYELA FDU-1200冷凍干燥機(jī)(日本東京理化器械株式會(huì)社)；LDZX-50KBS滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；ZHWY211B搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)；Sigma 6-16K離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；DZF-6020真空恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限責(zé)任公司)；Thermo Scientific酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；柱色譜硅膠(青島海洋化工有限公司)；反相硅膠RP-18(日本YMC公司)；色譜乙腈、色譜甲醇、分析甲醇、分析二氯甲烷(天津市康科德科技有限公司)；其他常用分析純?cè)噭┵?gòu)自天津禹王化學(xué)試劑廠。

1.1.2 菌株

真菌Penicilliumsp.SYP-F-7610分離自植物莢果蕨(Matteuccia struthiopteris)的根莖中，莢果蕨根莖樣品于2014年5月采自遼寧省本溪市草河口鎮(zhèn)(E123°73′、N41°3′)，經(jīng)基因測(cè)序鑒定為青霉屬真菌Penicilliumsp.。大腸埃希菌(Escherichia coliCMCC44103)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureusCMCC26003)、乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphiB CMCC50094)、銅綠假單胞菌(Pseudomon as aeruginosaCMCC10104)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereusATCC14579)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniaeCMCC46117)和白念珠菌(Candida albicansATCC5314)。以上菌種均保藏于沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院微生物資源中心。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar medium，PDA)：馬鈴薯200 g/L(切成1 cm3小塊，水煮沸20 min，濾汁)，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然，121℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L(切成1 cm3小塊，水煮沸20 min，濾汁)，葡萄糖20 g/L，pH自然，121℃滅菌30 min。

液體培養(yǎng)基：可溶性淀粉50.0 g/L，花生粉餅15.0 g/L，黃豆粉3.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，MgSO40.75 g，KH2PO41.0 g/L，pH自然，121℃滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂15 g/L，蒸餾水配制，調(diào)pH 7.2，121℃滅菌30 min。

TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g/L，大豆蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，蒸餾水配制，121℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株發(fā)酵

將菌株P(guān)enicilliumsp.SYP-F-7610在PDA培養(yǎng)基上活化后，用無(wú)菌水將孢子洗下，轉(zhuǎn)接到裝有50 mL種子液培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃搖床震蕩(150 r/min)培養(yǎng)3 d，按10%接種量接種到含有100 mL發(fā)酵液培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃搖床震蕩(150 r/min)培養(yǎng)7 d，發(fā)酵結(jié)束并經(jīng)過鏡檢后合并，得到發(fā)酵液30 L。

1.2.2 提取與分離

大規(guī)模發(fā)酵后用水飽和的乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，萃取3次，萃取液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取總浸膏(26.5 g)，將乙酸乙酯萃取總浸膏進(jìn)行硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇(體積比100:0～0:100,V/V)體系進(jìn)行梯度洗脫，得到13個(gè)流分(Fr.A～Fr.M)。其中Fr.B (280.0 mg)經(jīng)ODS柱色譜梯度洗脫分離，60%甲醇-水洗脫物再通過半制備型高效液相色譜(60%甲醇-水)純化得到化合物2 (40.5 mg)。Fr.C(15.1 g)采用硅膠柱色譜分離，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(體積比97:3-0:100,V/V)體系進(jìn)行梯度洗脫，得到7個(gè)子流分(Fr.C1-Fr.C7)。Fr.C3 (119.4 mg)、Fr.C4 (553.5 mg)和Fr.C5 (11.3 g)分別經(jīng)ODS柱色譜分離(甲醇-水梯度洗脫)，再通過半制備型高效液相色譜(流動(dòng)相分別為35%甲醇-水、50%甲醇-水和20%甲醇-水)純化得到化合物4(2.8 mg)、6(1.6 mg)和1(498.6 mg)。Fr.D(1.8 g)經(jīng)硅膠柱色譜(環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫)、ODS柱色譜(甲醇-水梯度洗脫)分離，再通過半制備型高效液相色譜(5%甲醇-水)純化得到化合物3(2.0 mg)和7(4.1 mg)。Fr.E (1.4 g)經(jīng)硅膠柱色譜(環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫)、ODS柱色譜(甲醇-水梯度洗脫)分離，再分別通過半制備型高效液相色譜(5%乙腈-水)純化得到化合物5 (60.8 mg)。

1.2.3 抑菌活性測(cè)試

將待測(cè)試樣品用DMSO溶解，母液濃度為10.0、5.0、2.5、1.25和0.625 mg/mL。陽(yáng)性對(duì)照左氧氟沙星(levofloxacin)、萬(wàn)古霉素(vancomycin)和氟康唑(fluconazole)用無(wú)菌蒸餾水溶解，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。將活化好的、接種在LB培養(yǎng)基上的病原菌用滅菌后的竹簽刮取適量，加入無(wú)菌蒸餾水中，震蕩搖勻，將菌體稀釋至108CFU/mL(細(xì)菌)或105CFU/mL(白念珠菌)。利用TSB液體培養(yǎng)基以10倍梯度稀釋法使菌懸液濃度分別為105CFU/mL(細(xì)菌)或103CFU/mL(白念珠菌)，配制成實(shí)驗(yàn)用菌液。在無(wú)菌的96孔板上進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組每孔加入198μL菌懸液和2 μL的待測(cè)樣品，平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照組：198 μL空白培養(yǎng)基+2 μL樣品。DMSO組每孔加入198 μL實(shí)驗(yàn)用菌液和2 μL DMSO以檢測(cè)溶劑影響，平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照組：198 μL空白培養(yǎng)基+2 μL DMSO。陰性對(duì)照組每孔加入198 μL菌懸液+2 μL無(wú)菌水來(lái)觀察菌株生長(zhǎng)情況，平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照組：198 μL空白培養(yǎng)基+2 μL 無(wú)菌水。將96孔板放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，白念珠菌培養(yǎng)24 h后，用酶標(biāo)儀在600 nm下測(cè)定吸光度值，計(jì)算化合物的抑菌率(樣品以DMSO為對(duì)照)。

抑菌率(%)=[(A溶劑組-A溶劑空白對(duì)照組)-(A實(shí)驗(yàn)組-A實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組)]/(A陰性對(duì)照組-A陰性空白對(duì)照組)×100%

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色油狀物；ESI-MSm/z：193.2[M+Na]+,169.0 [M-H]-;1H NMR (600 MHz,CDCl3)δH: 5.48 (1H,brs,H-6),5.22 (1H,brs,H-6),5.13 (1H,s,H-2),3.92 (3H,s,3-OCH3),1.79 (3H,s,H-7);13C NMR(150 MHz,CDCl3) δC: 179.1 (C-3),170.8 (C-1),139.9(C-5),116.6 (C-6),102.9 (C-4),89.6 (C-2),60.1 (3-OCH3),17.6 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物1為青霉酸。

化合物2：淡黃色粉末；ESI-MSm/z：233.2[M+Na]+,208.9 [M-H]-;1H NMR (600 MHz,CDCl3)δH: 5.21 (1H,s,4-OH),3.93 (3H,s,H-8),2.43 (3H,s,6-CH3),2.15 (3H,s,5-CH3),2.14 (3H,s,3-CH3);13C NMR (150 MHz,CDCl3) δC: 172.9 (C-7),159.8 (C-4),156.9 (C-2),137.7 (C-6),115.0 (C-5),107.5 (C-1),106.4 (C-3),52.1 (C-8),19.0 (6-CH3),12.0 (5-CH3),8.2(3-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物2為3,5,6-三甲基-2,4-二羥基苯甲酸甲酯。

化合物3：淡黃色油狀物；ESI-MSm/z：122.9[M-H]-;1H NMR (600 MHz,CDCl3) δH: 6.24 (2H,m,H-2,6),6.17 (1H,t,J=2.6 Hz,H-4),4.76 (2H,brs,3,5-OH),2.25 (3H,s,H-7);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δC: 156.8 (C-3,5),141.2 (C-1),108.9 (C-2,6),100.1 (C-4),21.6 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物3為苔黑酚。

化合物4：白色粉末；ESI-MSm/z：165.0 [M-H]-;1H NMR (600 MHz,CDCl3) δH: 7.15 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6),6.79 (2H,d,J=8.5Hz,H-3,5),3.70 (3H,s,H-9),3.56 (2H,s,H-7);13C NMR (150 MHz,CDCl3) δC: 172.6(C-8),154.9 (C-4),130.7 (C-2,6),126.4 (C-1),115.7(C-3,5),52.2 (C-9),40.5 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物4為4-羥基苯乙酸甲酯。

化合物5：淡黃色油狀物；ESI-MSm/z：211.2[M+Na]+,186.9 [M-H]-;+15.0 (c0.1,MeOH);1H NMR (600 MHz,CDCl3) δH: 5.08 (1H,s,H-6),4.12 (1H,m,H-2),3.93 (3H,s,5-OCH3),3.83 (1H,m,H-2),2.48(1H,m,H-3),0.71 (3H,d,J=7.3 Hz,3-CH3);13C NMR(150 MHz,CDCl3) δC: 178.4 (C-5),171.3 (C-7),106.5 (C-4),89.5 (C-6),65.1 (C-2),59.7 (5-OCH3),37.5 (C-3),11.1 (3-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物5為6-hydroxy-5-methoxy-3-methyl-3,6-dihydro-2H-pyran-4-carboxylic acid。

化合物6：黃色油狀物；HR-ESI-MSm/z：291.1595 [M+H]+;+295.0 (c0.1,MeOH);1H NMR(600 MHz,CDCl3) δH: 6.80 (1H,s,H-1),5.98 (1H,s,H-3),5.38 (1H,d,J=1.2 Hz,H-4),4.10 (1H,brs,6-OH),3.27 (1H,dt,J=9.6,1.8 Hz,H-7),3.21 (1H,dd,J=17.4,1.8 Hz,H-10),2.75 (1H,dd,J=17.4,9.6 Hz,H-10),2.61(1H,m,H-12),2.12 (3H,s,H-15),1.74 (1H,m,H-13),1.43 (1H,m,H-13),1.16 (3H,d,J=6.6 Hz,H-17),1.08(3H,s,H-16),0.90 (3H,t,J=7.4 Hz,H-14);13C NMR(150 MHz,CDCl3) δC: 213.2 (C-11),199.1 (C-5),158.4(C-2),147.8 (C-9),144.8 (C-1),120.3 (C-8),107.1 (C-3),103.9 (C-4),73.0 (C-6),47.7 (C-12),40.3 (C-7),37.5(C-10),25.9 (C-13),21.2 (C-16),19.3 (C-15),16.4 (C-17),11.7 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物6為chermesinone A。

化合物7：淡黃色油狀物；ESI-MSm/z：153.1[M+Na]+,131.2 [M+H]+;-25.6 (c0.1,MeOH);1H NMR (600 MHz,CD3OD) δH: 4.56 (1H,td,J=18.4,7.0 Hz,H-6),4.37 (1H,m,H-6),2.55 (2H,m,H-5),1.98(1H,m,H-3),1.83 (1H,m,H-3),1.32 (3H,s,H-7);13C NMR (150 MHz,CD3OD) δC: 173.9 (C-2),68.6 (C-4),67.8 (C-6),45.2 (C-3),36.6 (C-5),29.6 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]對(duì)照基本一致，因此鑒定化合物7為(R)-甲羥戊酸內(nèi)酯。

2.2 化合物抑菌活性測(cè)試

采用比濁法測(cè)試了化合物1～2和5對(duì)7株人類致病菌的抑菌活性(其余化合物因量少未進(jìn)行測(cè)試)，測(cè)試結(jié)果表明，化合物1對(duì)大腸埃希菌(Escherichia coliCMCC44103)、乙型副傷寒沙門菌(Salmonela paratyphiB CMCC50094)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereusATCC14579)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniaeCMCC46117)具有抑制作用，IC50值分別為4.00、4.62、3.19和6.79 μg/mL，對(duì)其他人類致病菌均未顯示出抑制活性(IC50＞100 μg/mL)?；衔?和5對(duì)所測(cè)的7株人類致病菌均未顯示出抑制活性(IC50＞100 μg/mL)。

3 結(jié)論和討論

莢果蕨(Matteuccia struthiopteris)為球子蕨科莢果蕨屬多年生草本植物，本課題組前期對(duì)莢果蕨進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)了一系列黃酮類、萜類、苯丙素類等成分，部分化合物表現(xiàn)出較好的抗流感病毒活性[22-23]。而莢果蕨屬植物的內(nèi)生真菌研究目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文從經(jīng)前期篩選具有抑菌活性的莢果蕨根莖內(nèi)生真菌Penicilliumsp.SYP-F-7610的發(fā)酵液中分離鑒定了7個(gè)化合物，包括內(nèi)酯類、酚酸類、azaphilones類等結(jié)構(gòu)類型，其中化合物5為首次報(bào)道從青霉屬真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到?；衔?(青霉酸)在多株真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物研究中均有報(bào)道，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、蠟樣芽胞桿菌、李斯特菌、鼠傷寒沙門菌、肺炎克雷伯菌、白念珠菌等病原菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用[24-27]，此外還具有抗瘧[24]、細(xì)胞毒[28-30]、抑制乙酰膽堿酯酶[26]等活性。本文的活性測(cè)試結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了化合物1對(duì)大腸埃希菌、蠟樣芽胞桿菌和肺炎克雷伯菌的抑制作用，同時(shí)首次報(bào)道其對(duì)乙型副傷寒沙門菌具有抑制活性?；衔?(苔黑酚)文獻(xiàn)報(bào)道具有抑制HIV-1誘導(dǎo)的合胞體合成的作用[31]，與實(shí)驗(yàn)菌株的宿主植物莢果蕨防治病毒感染性疾病的民間應(yīng)用具有一定的相關(guān)性?；衔?～7在文獻(xiàn)報(bào)道中還表現(xiàn)出抑菌[16,32-33]、抗氧化[34]、抑制α-葡萄糖苷酶[20]、抑制NO釋放[35]、抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶[36]以及植物毒性[37]等生物活性。上述結(jié)果表明莢果蕨根莖內(nèi)生真菌Penicilliumsp.SYP-F-7610的次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型豐富、生物活性多樣，可對(duì)該菌株及莢果蕨植物的其它內(nèi)生真菌開展深入研究，以期發(fā)現(xiàn)更多的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，豐富莢果蕨植物內(nèi)生真菌的研究?jī)?nèi)容。

致謝：本研究工作獲得遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新人才支持計(jì)劃(LR2019072)和國(guó)家科技基礎(chǔ)資源調(diào)查專項(xiàng)“我國(guó)主要沿海灘涂特色微生物資源調(diào)查”——灘涂微生物培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)化及功能微生物培養(yǎng)和收集(2019FY100700)的支持。