王森 洪葵 霍瑞云 賈佳 孫立彥,* 劉玲,*

(1 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)藥學(xué)院，泰安 271016；2 武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430070；3 中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點實驗室，北京 100101；4 南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南京 211166)

天然產(chǎn)物是藥物先導(dǎo)化合物的重要來源，海洋微生物因其豐富多樣的特性逐漸成為天然產(chǎn)物開發(fā)的熱點領(lǐng)域。海洋真菌是生存在寡營養(yǎng)、含鹽、弱堿性的海水環(huán)境中的一大類微生物群體，為適應(yīng)其生長環(huán)境，可能具有獨特代謝途徑和防御體制，從而產(chǎn)生系列結(jié)構(gòu)新穎、功能豐富的生物活性代謝產(chǎn)物。近20年來，海洋真菌來源天然產(chǎn)物在種類和數(shù)量上呈逐年遞增趨勢，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的新的次級代謝產(chǎn)物數(shù)量有幾千種，這些天然產(chǎn)物大多為生物堿、聚酮、萜類和大環(huán)內(nèi)酯等結(jié)構(gòu)[1-4]，且具有抗癌、抗菌、抗病毒和抗氧化等生物活性[5-7]，因此海洋真菌也逐漸成為藥物開發(fā)的重要來源之一。蛇孢菌素(ophiobolin)類化合物是一類以[5,8,5]三環(huán)為基本骨架的二倍半萜類化合物，這類化合物主要由Aspergillussp.和Bipolarissp.產(chǎn)生[8]。1957年，日本學(xué)者從植物病原真菌Bipolaris oryzae中分離出第一個蛇孢菌素化合物，命名為ophiobolin A[9]。隨后越來越多的蛇孢菌素類化合物被分離和鑒定，該類化

合物也具有廣泛的生物活性，包括植物毒性[10]、抗腫瘤[11-13]、抗菌活性[14-15]、抗病毒[16]、殺線蟲[17]和抗炎活性[18]等。本研究以一株分離自深海沉積物真菌Aspergillussp.WHUF0313為研究對象，從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得9個化合物，通過核磁波譜數(shù)據(jù)和文獻對比分別鑒定為：asperophiobolin G(1)[19]、asperophiobolin F(2)[19]、ophiobolin Q(3)[20]、asperophiobolin H(4)[19]、6-epi-ophiobolin G(5)[21]、ophiobolin H(6)[21]、6-epiophiobolin K(7)[21]、6-epi-21,21-O-dihydroophiobolin G(8)[22]和asperophiobolin J(9)[19]，并進行了體外抗菌試驗和細胞毒活性評價，化合物1～9的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～9結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1～9

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會社)；高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；高速低溫離心機(美國Sigma公司)；高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)；生化培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；FlexStation 3酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)。甲醇、氯仿、乙酸乙酯和丙酮(分析純，北京化工廠)；色譜甲醇及色譜乙腈(德國Emoon公司)；柱層析硅膠(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(通用Helthcare公司)；柱層析反相硅膠(YMC公司)。

1.1.2 菌株來源

菌株Aspergillussp.WHUF0313為武漢大學(xué)藥學(xué)院洪葵課題組分離自深海沉積物，因其PDA固體培養(yǎng)物的甲醇提取物經(jīng)初步抗菌活性篩選有較強的抗金黃色葡萄球菌活性，并且經(jīng)HPLC-DAD分析呈現(xiàn)系列吸收峰，被選出進行化合物分離鑒定。對該菌株提取DNA，通過內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer region,ITS)序列進行比對，初步鑒定為曲霉屬(Aspergillussp.)真菌。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar,PDA)：新鮮去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，去離子水1000 mL。

(2)種子液培養(yǎng)基：酵母提取物4 g，葡萄糖4 g，麥芽糖提取物10 g，去離子水1000 mL。

(3)大米海鹽培養(yǎng)基：大米100 g，無菌水120 mL，海鹽2 g。

1.2 方法

1.2.1 菌株發(fā)酵

將菌株Aspergillussp.WHUF0313從凍存管中接至PDA平板活化，28℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，長至2/3培養(yǎng)基后，觀察記錄菌落形態(tài)。切取3～4塊0.5 cm2菌塊接種至已滅菌的種子液培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3～4 d，以5%的接種量接種至添加1%海鹽的固體大米培養(yǎng)基(4 kg)中，28℃恒溫避光靜置發(fā)酵30 d。

1.2.2 化合物分離純化

發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)乙酸乙酯(EtOAc)浸泡萃取，減壓濃縮得粗提物29.3 g。粗提物經(jīng)正相減壓硅膠柱層析分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(20:1，15:1，10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2)，100%甲醇洗脫，經(jīng)薄層層析(TLC)分析合并相似組分后，得到9個組分(Fr.1～Fr.9)。Fr.2經(jīng)ODS反相柱層析,甲醇:水(30:70～100:0)分離得到9個組分(Fr.2-1～Fr.2-9)，其中Fr.2-9經(jīng)半制備液相甲醇:水(87:13)得到化合物5(2 mg,tR30 min)、化合物6(4 mg,tR50 min)、化合物7(4 mg,tR32 min)、化合物8(2.5 mg,tR55 min)和化合物9(4 mg,tR16 min)。Fr.6經(jīng)ODS反相柱層析,甲醇:水(30:70～100:0)分離得到7個組分(Fr.6-1～Fr.6-7)，其中Fr.6-6經(jīng)半制備液相甲醇:水(50:50)制備得到化合物1(4 mg,tR26.5 min)、化合物3(5 mg,tR24 min)和化合物4(5 mg,tR25.5 min)。Fr.8經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇:二氯甲烷(1:1)分離，收集得到10個組分(Fr.8-1～Fr.8-10)，其中Fr.8-9～10合并，經(jīng)半制備液相甲醇:水(45:55)制備得到化合物2(5 mg,tR21 min)。

1.2.3 體外抗菌活性測試

采用肉湯微量稀釋法[23]檢測化合物1～9對多種致病菌的抑制作用。實驗所采用的指示菌為幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)以及糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，菌株編號見表1。96孔板中第1孔加188 μL的相應(yīng)培養(yǎng)基，其中幽門螺桿菌培養(yǎng)應(yīng)用腦心浸出液培養(yǎng)基(BHI)，其他非幽門螺桿菌菌株培養(yǎng)用M-H培養(yǎng)基。另外加入2 μL 6.4 mg/mL的待測化合物溶液母液，在96孔板進行二倍倍比稀釋，每孔待測化合物終濃度分別為64、32、16、8、4、2和1 μg/mL，再加入10 μL待測菌液，其中幽門螺桿菌終濃度為5×105～1×106CFU/mL，其他非幽門螺桿菌株終濃度為5×104～1×105CFU/mL，幽門螺桿菌需放置于微需氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，其他菌株在37℃細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，然后對細菌培養(yǎng)液渾濁度進行觀察，培養(yǎng)液最澄清的孔所對應(yīng)的藥物濃度為該待測藥物的最小抑菌濃度MIC(minimum inhibitory concentration，MIC)，甲硝唑或氨芐西林作陽性對照，DMSO作陰性對照，空培養(yǎng)基作空白對照。該實驗需重復(fù)3次。

表1 化合物1～9的抗菌活性結(jié)果Tab.1 Antibacterial activities of compounds 1～9

1.2.4 細胞毒活性測試

采用MTS法[24]測試細胞毒性，將小鼠黑色素瘤(B16)、人乳腺癌細胞(MCF-7)和人肝癌細胞(HepG2)從液氮內(nèi)取出，于37℃水浴2 min，離心去上清，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2靜置培養(yǎng)。將胰酶、培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)預(yù)熱至37℃，PBS沖洗細胞培養(yǎng)液，棄掉PBS后使用含EDTA的0.25%胰酶消化2 min，再加入同體積含血清的完全培養(yǎng)基用于終止反應(yīng)。移液管吹打制成單細胞懸液，培養(yǎng)皿內(nèi)加入1:3～1:4單細胞，再加入10 mL培養(yǎng)基于37℃、5% CO2靜置培養(yǎng)，獲得傳代細胞。將對數(shù)生長期的細胞消化后計數(shù)，按3×103個/孔加入96孔板，培養(yǎng)過夜使細胞貼壁，去除培養(yǎng)基后加入無酚紅無血清DMEM培養(yǎng)基100 μL/孔，DMSO溶解陽性對照及化合物加入96孔板，倍比稀釋，使其濃度為100、50、25、12.5、6.25和3.13 μmol/L，空白對照加入等體積的有機溶劑DMSO，每組有3個平行孔，在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h，每孔加配置好的MTS:PMS=20:1(V/V)的混合溶液20 μL，37℃黑暗條件下培養(yǎng)90 min。490 nm酶標(biāo)儀測定各孔光吸收值，計算抑制率，Prism 6.0軟件計算IC50值。重復(fù)3次實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)解析

化合物1：無色油狀，ESIMS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z401.27 [M+H]+，結(jié)合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H36O4，不飽和度為8。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.23 (1H,s,H-21),6.86 (1H,dd,J=2.4,6.6 Hz,H-8),5.88 (1H,s,H-4),5.43 (1H,overlap,H-16),5.41 (1H,overlap,H-17),4.22 (1H,d,J=9.0 Hz,H-18),3.32 (1H,d,J=4.5 Hz,H-6),3.24 (dt,J=20.7,3.2 Hz,H-9a),2.78 (1H,m,H-10),2.70 (1H,m,H-2),2.62 (1H,m,H-15),2.37 (1H,m,H-9b),2.06 (3H,s,H-20),2.02(1H,m,H-1a),1.97 (1H,m,H-14),1.67 (1H,m,H-13a),1.50 (1H,m,H-12a),1.39 (1H,m,H-12b),1.34 (1H,m,H-13b),1.23 (1H,t,J=13.0 Hz,H-1b),1.17 (3H,s,H-25),1.13 (3H,s,H-24),0.98 (3H,d,J=6.5 Hz,H-23),0.91 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6)δC: 206.1 (C-5),193.2 (C-21),176.9 (C-3),157.9 (C-8),141.3 (C-16),140.8 (C-7),130.7 (C-4),128.5 (C-17),74.9 (C-18),72.6 (C-19),52.7 (C-14),50.5 (C-6),49.9(C-2),46.6 (C-1),46.2 (C-11),44.9 (C-12),44.4 (C-10),33.5 (C-15),31.4 (C-9),28.3 (C-13),26.8 (C-25),24.9(C-24),23.1 (C-22),21.5 (C-23),16.9 (C-20)。1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與文獻[19]數(shù)據(jù)比對一致，因此鑒定該化合物為asperophiobolin G。

化合物2：無色油狀，ESIMS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z401.27 [M+H]+，結(jié)合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H36O4，不飽和度為8。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.38 (1H,s,H-21),7.11 (1H,dd,J=7.1,3.3 Hz,H-8),5.99 (1H,s,H-4),5.33 (1H,overlap,H-16),5.32 (1H,overlap,H-17),4.18 (1H,m,H-6),4.04 (1H,d,J=8.1 Hz,H-18),3.14 (1H,m,H-2),2.88 (1H,dt,J=19.8,3.7 Hz,H-9a),2.64 (1H,m,H-15),2.57 (1H,m,H-9b),2.23 (3H,s,H-20),2.20 (1H,m,H-10),1.94 (1H,m,H-14),1.85 (1H,m,H-1a),1.65 (1H,m,H-13a),1.48(1H,m,H-12a),1.41 (1H,m,H-13b),1.36 (1H,m,H-1b),1.30 (1H,m,H-12b),1.14 (3H,s,H-25),1.12 (3H,s,H-24),0.89 (3H,d,J=6.7 Hz,H-23),0.82 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6) δC: 206.4 (C-5),195.4(C-21),177.9 (C-3),160.5 (C-8),141.7 (C-16),138.9 (C-7),131.1 (C-4),127.2 (C-17),74.8 (C-18),72.7 (C-19),49.3 (C-2),48.9 (C-6),47.0 (C-14),46.8,(C-11),40.7 (C-10),40.7 (C-12),36.3 (C-1),36.3 (C-15),30.5 (C-9),28.3(C-13),26.7 (C-25),24.9 (C-22),24.5 (C-24),20.7 (C-23),18.6 (C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)譜與文獻[19]數(shù)據(jù)比對一致，因此鑒定該化合物為asperophiobolin F。

化合物3：無色油狀，ESIMS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z401.27 [M+H]+，結(jié)合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H36O4，不飽和度為8。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.23 (1H,s,H-21),6.83 (1H,dd,J=6.6,2.6 Hz,H-8),5.88 (1H,s,H-4),5.59 (1H,dd,J=11.0,8.6 Hz,H-16),5.51 (1H,dd,J=11.0,9.2 Hz,H-17),4.19 (1H,d,J=9.2 Hz,H-18),3.35 (1H,d,J=4.3 Hz,H-6),3.06 (1H,dt,J=20.0,3.3 Hz,H-9a),2.86 (1H,m,H-2),2.73 (1H,m,H-10),2.62 (1H,m,H-15),2.36 (1H,m,H-9b),2.11 (1H,dd,J=13.1,3.7 Hz,H-1a),2.07(3H,s,H-20),2.01 (1H,m,H-14),1.67 (1H,m,H-13a),1.53 (1H,m,H-12a),1.48 (1H,m,H-12b),1.35 (1H,m,H-13b),1.22 (1H,t,J=13.1 Hz,H-1b),1.19 (3H,s,H-24),1.17 (3H,s,H-25),1.06 (3H,d,J=6.8 Hz,H-23),0.90 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6)δC: 206.1 (C-5),193.2 (C-21),176.9 (C-3),156.9 (C-8),141.8 (C-16),141.7 (C-7),130.7 (C-4),129.3 (C-17),74.7 (C-18),72.9 (C-19),52.9 (C-14),50.5 (C-6),49.9(C-2),46.6 (C-11),46.1 (C-1),45.0 (C-12),44.3 (C-10),33.6 (C-15),32.1 (C-9),28.2 (C-13),26.3 (C-25),25.3(C-24),22.9 (C-22),22.3 (C-23),16.9 (C-20)。1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與文獻[20]數(shù)據(jù)比對一致，因此鑒定該化合物為ophiobolin Q。

化合物4：無色油狀，ESIMS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z401.27 [M+H]+，結(jié)合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H36O4，不飽和度為8。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.39 (1H,s,H-21),7.09 (1H,dd,J=7.2,3.1 Hz,H-8),6.00 (1H,s,H-4),5.41 (1H,overlap,H-16),5.40 (1H,overlap,H-17),4.14 (1H,d,J=7.2 Hz,H-18),4.05 (1H,d,J=7.6 Hz,H-6),3.14 (1H,m,H-2),2.82(1H,m,H-9a),2.68 (1H,m,H-15),2.48 (1H,m,H-9b),2.27 (1H,m,H-10),2.24 (3H,s,H-20),1.96 (1H,m,H-13a),1.88 (3H,m,H-1a),1.63 (1H,m,H-13b),1.40(1H,m,H-12a),1.35 (H,m,H-1b),1.30 (1H,m,H-12b),1.19 (3H,s,H-25),1.16 (3H,s,H-24),0.94 (3H,d,J=6.7 Hz,H-23),0.80 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6) δC: 206.1 (C-5),195.4 (C-21),177.9 (C-3),159.7 (C-8),142.5 (C-16),139.2 (C-7),131.1 (C-4),127.5 (C-17),74.6 (C-18),72.9 (C-19),49.4 (C-2),48.9(C-6),47.4 C-11),46.7 (C-14),40.9 (C-12),40.9 (C-10),36.3 (C-1),36.1 (C-15),30.8 (C-9),28.0 (C-13),26.4(C-25),25.0 (C-22),24.6 (C-24),21.2 (C-23),18.6 (C-20)。1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與文獻[19]數(shù)據(jù)比對一致，因此鑒定該化合物為asperophiobolin H。

化合物5：無色油狀，ESIMS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z367.26 [M+H]+，結(jié)合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H34O2，不飽和度為9。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.23 (1H,s,H-21),6.84 (1H,dd,J=6.5,2.5 Hz,H-8),6.13 (1H,overlap,H-17),6.16 (1H,d,J=10.1 Hz,H-18),5.87 (1H,s,H-4),5.26 (1H,d,J=9.1 Hz,H-16),3.35 (1H,d,J=4.5 Hz,H-6),2.89 (1H,m,H-9a),2.72 (1H,m,H-2),2.69 (1H,m,H-10),2.62 (1H,m,H-15),2.18 (1H,m,H-9b),2.07 (3H,s,H-20),2.02(1H,m,H-1a),1.88 (1H,m,H-14),1.82 (3H,s,H-25),1.78 (3H,s,H-24),1.63 (1H,m,H-13a),1.52 (2H,m,H-12a),1.42 (1H,m,H-12b),1.28 (1H,m,H-13b),1.19(1H,m,H-1b),0.97 (3H,d,J=6.8 Hz,H-23),0.91 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6) δC: 206.1 (C-5),193.3 (C-21),176.9 (C-3),157.1 (C-8),141.8 (C-7),138.5 (C-19),135.4 (C-16),130.7 (C-4),124.5 (C-17),121.3 (C-18),52.5 (C-14),50.5 (C-6),49.9 (C-2),46.5(C-1),45.3,(C-11),44.3 (C-12),44.2 (C-10),33.3 (C-15),31.4 (C-9),27.3 (C-13),26.5 (C-25),23.1 (C-22),21.6 (C-23),18.1 (C-24),16.9 (C-20)。1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與文獻[21]數(shù)據(jù)比對一致，因此鑒定該化合物為6-epi-ophiobolin G。

化合物6：無色油狀，ESIMS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z387.29 [M+H]+，結(jié)合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H38O3，不飽和度為7。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH: 6.10 (1H,d,J=11.5 Hz,H-18),6.02(1H,t,J=11.5 Hz,H-17),5.55 (1H,m,H-8),5.24 (1H,t,J=10.2 Hz,H-16),4.43 (2H,overlap,H-21),3.13 (1H,m,H-6),2.77 (1H,m,H-15),2.52 (1H,m,H-9a),2.24(1H,m,H-2),2.10 (1H,m,H-14),2.02 (2H,overlap,H-4),1.78 (3H,s,H-25),1.75 (1H,m,H-13a),1.71 (3H,s,H-24),1.61 (1H,m,H-9b),1.58 (1H,m,H-10),1.53(1H,m,H-1a),1.42 (2H,m,H-1b,12a),1.38 (1H,m,H-12b),1.30 (1H,m,H-13b),1.15 (3H,s,H-20),0.95(3H,s,H-22),0.88 (3H,d,J=6.7 Hz,H-23);13C NMR(125 MHz,Acetone-d6) δC: 142.2 (C-7),138.8 (C-16),135.1 (C-19),122.6 (C-8),122.0 (C-17),121.4 (C-18),117.2 (C-5),80.0 (C-3),71.8 (C-21),56.2 (C-10),54.5(C-6),52.4 (C-2),51.4 (C-4),48.1 (C-14),44.3 (C-11),43.9 (C-12),37.1 (C-1),36.2 (C-15),27.3 (C-13),26.4(C-25),26.3 (C-20),25.7 (C-9),20.6 (C-23),19.0 (C-22),18.1 (C-24)。1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與文獻[21]數(shù)據(jù)比對，鑒定該化合物為ophiobolin H。

化合物7：無色油狀，ESIMS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z385.27 [M+H]+，結(jié)合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H36O3，不飽和度為9。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.17 (1H,s,H-21),6.92 (1H,dd,J=6.9,2.4 Hz,H-8),6.15 (1H,overlap,H-17),6.12 (1H,overlap,H-18),5.29 (1H,t,J=9.4 Hz,H-16),3.17 (1H,d,J=10.6 Hz,H-6),2.90 (1H,d,J=16.5 Hz,H-4a),2.87 (1H,m,H-9a),2.69 (1H,m,H-10),2.62 (1H,m,H-15),2.34 (1H,m,H-9b),2.27 (1H,dd,J=16.5,1.5 Hz,H-4b),2.09 (1H,m,H-2),2.07 (1H,overlap,H-14),1.97 (1H,m,H-1a),1.82 (3H,s,H-25),1.73 (3H,s,H-24),1.67 (1H,m,H-13a),1.50 (1H,m,H-1b),1.49(1H,m,H-12a),1.46 (1H,m,H-12b),1.40 (3H,s,H-20),1.30 (1H,m,H-13b),0.98 (3H,d,J=6.8 Hz,H-23),0.88 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6)δC: 215.7 (C-5),194.9 (C-21),159.9 (C-8),143.2 (C-7),137.0 (C-19),136.2 (C-16),124.5 (C-17),121.3 (C-18),76.2 (C-3),55.7 (C-4),52.9 (C-14),50.9 (C-2),49.6(C-6),46.1 (C-12),45.5 (C-11),44.6 (C-10),42.4 (C-1),33.3 (C-15),31.4 (C-9),28.3 (C-13),26.5 (C-25),25.8(C-20),23.5 (C-22),21.6 (C-23),18.1 (C-24)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[21]數(shù)據(jù)比對一致，因此鑒定該化合物為6-epi-ophiobolin K。

化合物8：無色油狀，ESIMS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z369.28 [M+H]+，結(jié)合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H36O2，不飽和度為8。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH: 6.10 (2H,overlap,H-17,18),5.82(1H,s,H-4),5.61 (1H,d,J=6.0 Hz,H-8),5.22 (1H,t,J=10.0 Hz,H-16),4.16 (1H,m,H-21a),3.86 (1H,d,J=12.0 Hz,H-21b),3.45 (1H,d,J=3.5 Hz,H-6),2.89 (1H,overlap,H-2),2.67 (1H,m,H-10),2.67 (1H,m,H-15),2.51 (1H,m,H-9a),2.09 (1H,dd,J=13.0,3.5 Hz,H-1a),2.06 (1H,overlap,H-20),1.94 (1H,m,H-9b),1.80 (3H,s,H-25),1.72 (3H,s,H-24),1.63 (1H,m,H-14),1.52 (1H,m,H-13a),1.46 (1H,m,H-12a),1.33 (1H,m,H-12b),1.29 (1H,m,H-13b),1.18 (1H,m,H-1b),1.04 (3H,s,H-22),0.94 (3H,d,J=6.5 Hz,H-23);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6) δC: 208.2 (C-5),179.5(C-3),137.7 (C-16),135.7 (C-19),135.6 (C-7),130.5(C-4),129.6 (C-8),124.0 (C-17),121.4 (C-18),66.6 (C-21),53.1 (C-6),52.9 (C-14),51.4 (C-2),47.1 (C-1),45.8(C-11),45.0 (C-12),44.4 (C-10),33.1 (C-15),28.4 (C-9),26.4 (C-13),26.4 (C-24),23.1 (C-22),21.6 (C-23),18.1 (C-25),17.3 (C-20)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[22]數(shù)據(jù)比對一致，因此鑒定該化合物為6-epi-21,21-Odihydroophiobolin G。

化合物9：無色油狀，ESIMS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z419.28 [M+H]+，結(jié)合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H38O5，不飽和度為9。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.17 (1H,s,H-21),6.94 (1H,dd,J=6.5,2.0 Hz,H-8),5.46 (1H,dd,J=11.5,9.5 Hz,H-16),5.41(1H,dd,J=11.5,9.5 Hz,H-17),4.20 (1H,d,J=9.0 Hz,H-18),3.16 (1H,d,J=9.9 Hz,H-6),2.91 (1H,d,J=16.0 Hz,H-4a),2.84 (1H,overlap,H-9a),2.67 (1H,m,H-15),2.58 (1H,ddd,J=14.5,10.0,4.0 Hz,H-10),2.35 (1H,m,H-9b),2.27 (1H,dd,J=16.0,1.5 Hz,H-4b),2.09 (1H,m,H-2),1.95 (1H,m,H-14),1.80 (1H,dd,J=13.5,4.5 Hz,H-1a),1.73 (1H,m,H-13a),1.66 (1H,m,H-1b),1.51 (1H,m,H-12a),1.46 (1H,m,H-12b),1.40 (3H,s,H-20),1.31(1H,m,H-13b),1.16 (3H,s,H-25),1.13 (3H,s,H-24),0.99 (3H,d,J=6.5 Hz,H-23),0.89 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6) δC: 215.8 (C-5),194.8 (C-21),160.8 (C-8),142.8 (C-16),140.6 (C-7),128.5 (C-17),76.2 (C-3),74.9 (C-18),72.6 (C-19),55.8 (C-4),52.8 (C-14),50.9 (C-2),49.6 (C-6),46.0 (C-12),45.6 (C-11),44.6(C-10),42.4 (C-1),33.4 (C-15),31.3 (C-9),28.2 (C-13),26.7 (C-25),25.8 (C-20),24.9 (C-24),23.6 (C-22),21.5(C-23)。1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與文獻[19]數(shù)據(jù)比對一致，因此鑒定該化合物為asperophiobolin J。

2.2 體外抗菌活性

對化合物進行抗多重耐藥(耐甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星)幽門螺桿菌H.pylori159、多重耐藥(耐克拉霉素、阿莫西林)幽門螺桿菌H.pylori129、金黃色葡萄球菌(S.aureusATCC25923、S.aureusNEWMAN)、屎腸球菌(E.faeciumATCC19434)以及糞腸球菌(E.faecalisFA2-2)的活性測試，結(jié)果顯示化合物6對幽門螺桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌和糞腸球菌均有一定程度的抑菌活性，MIC值分別為16、4、16和16 μg/mL。化合物7對幽門螺桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌活性，MIC值為16 μg/mL，實驗結(jié)果如表1。

2.3 細胞毒活性

對化合物1～9進行了細胞毒活性測試，測試結(jié)果顯示化合物4對B16和MCF-7具細胞毒活性，IC50值分別為(74.63±17.23)和(96.43±2.81) μmol/L；化合物3對B16、MCF-7和HepG2均有細胞毒活性，IC50值分別是(33.50±6.91)、(70.79±6.72)和(66.41±6.61) μmol/L。順鉑為陽性對照，IC50值分別為(20.45±0.66)、(3.80±0.20)和(10.44±1.55) μmol/L。

3 討論

本研究從一株深海來源曲霉屬真菌WHUF0313發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到9個蛇孢菌素類化合物，分別為：asperophiobolin G(1)、asperophiobolin F(2)、ophiobolin Q(3)、asperophiobolin H(4)、6-epiophiobolin G(5)、ophiobolin H(6)、6-epi-ophiobolin K(7)、6-epi-21,21-O-dihydroophiobolin G(8)和asperophiobolin J(9)。根據(jù)文獻報道，這9個蛇孢菌素類化合物主要是抗炎、抗菌和抗腫瘤活性：化合物3、4、5和9均具有一定的抗炎活性[19,25]；化合物5、6和7對不同的致病菌均具有抑制生長的能力[26-29]；化合物3、5、7和8對多種腫瘤細胞具有細胞毒活性[13,20-21,30]。本研究對分離得到的化合物進行了細胞毒活性評價，發(fā)現(xiàn)化合物4對B16和MCF-7具有細胞毒活性；化合物3對B16、MCF-7和HepG2細胞均有細胞毒活性。同時對化合物1～9進行體外抗菌活性評價，本研究首次報道了化合物6和7對兩種多重耐藥幽門螺桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑制作用，可在此基礎(chǔ)上對該菌株進一步研究，通過優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)條件對其次級代謝產(chǎn)物進行深入研究，更好的幫助我們?nèi)ふ姨烊豢咕钚曰衔?，為臨床上抗菌藥物的開發(fā)提供借鑒。本研究結(jié)果豐富了海洋來源曲霉屬真菌活性次級代謝產(chǎn)物，表明海洋真菌是生物活性次級代謝產(chǎn)物的重要來源，以海洋來源真菌為切入點開發(fā)抗菌藥物具有較大潛力和廣闊前景。